植物SINA E3泛素連接酶功能的研究進展

湯曉麗 姜福東 張洪霞

（1.魯東大學農林工程研究院，煙臺 264025；2.煙臺市農業科學研究院，煙臺 264000）

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）是真核生物細胞中重要且廣泛存在的蛋白平衡調節系統，通過介導細胞中錯誤折疊、受損傷、壽命較短的特別是具有調節作用的蛋白質（轉錄因子和信號激酶）的泛素化降解，幾乎參與細胞中所有的生物學過程，是細胞中一種重要的翻譯后調節機制，更是細胞正常生命活動秩序不可或缺的重要調節系統［1-4］。UPS由泛素激活酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、含76個氨基酸的泛素分子及26S蛋白酶體構成［5］。其中，泛素連接酶E3的種類和數量復雜多樣決定UPS所降解靶蛋白的特異性［3］。

SINA（seven in absentia）E3泛素連接酶是一類RING（really interesting new gene）型E3泛素連接酶，蛋白的N端具有負責與E2酶結合的RING結構域，C端是典型的SINA結構域，負責蛋白的二聚體化以及與底物蛋白的結合［6-7］。最早關于SINA E3泛素連接酶的報道來自果蠅。在果蠅眼睛R7視光細胞的分化發育過程中，果蠅SINA發揮重要作用［8］。哺乳動物小鼠的SINA在脊椎動物的發育衍化過程中具有重要作用［9］。果蠅SINA編碼的E3泛素連接酶與轉錄抑制子Tramtrack（TTK）互作，介導TTK泛素化降解，影響果蠅眼睛R7細胞向視光細胞的分化［10］。同年，在人類中也發現了SINA的同源基因，隨著研究的不斷深入，越來越多的研究表明SINA編碼的E3泛素連接酶在生物體中的作用重要且廣泛［11-16］。然而，與動物相比，SINA E3泛素連接酶在植物中的研究起步較晚（表1）。本研究對目前SINA在植物中的功能研究進展進行總結概述。

表1 目前研究報道的植物體中的SINATable 1 Reported SINA genes in plant at present

1 SINA E3泛素連接酶在植物生長發育中的功能

擬南芥（Arabidopsis thaliana）SINAT5是植物體中第一個被發現的SINA E3泛素連接酶。2002年，Xie等［23］以AtNAC1為誘餌蛋白，尋找互作蛋白時發現了SINAT5。進一步研究發現，SINAT5與AtNAC1互作，并將其泛素化，進而通過泛素介導的蛋白酶體途徑將其降解，終止植物體由AtNAC1傳導的生長素信號，實現了對植物側根發育的調控。雖然生長素信號可以同時誘導SINAT5和AtNAC1（2個在生長素信號傳導中具有拮抗作用的基因）的表達，但是，在生長素信號的傳導中，SINAT5對AtNAC1的翻譯后調節發揮了最終的決定性作用，調

節了植物的生長發育。另外，置換SINAT5的RING結構域酶活位點的關鍵氨基酸，使其喪失泛素連接酶活性，其對應的超表達株系則表現出側根數量增加。SINAT5以二聚體形式發揮作用，雖然突變的SINAT5仍可以參與二聚體化，但不具有連接酶的活性，因此，突變的SINAT5競爭性抑制了活性二聚體的產生，發揮了相反的生物學作用［23］。2008年，den Herder等［18］在苜蓿中進行了SINAT5異源表達，得到了相同的結果。超表達SINAT5轉基因苜蓿側根數量明顯減少，而SINAT5功能缺失突變體（SINAT5DN）的側根數量明顯增加［18］。超表達SINAT5DN轉基因植株的地上部長勢和葉片大小明顯優于野生型［18］。綜上所述，SINA E3泛素連接酶對植物正常生長發育具有重要作用。

續表Continued

Park等［24］發現在擬南芥由營養生長向生殖生長轉變的過程中，SINAT5參與調控了擬南芥的開花。FLC（flowering locus C）是一個MADS-box轉錄因子，與SINAT5互作，通過抑制成花誘導過程中的一系列基因（如FT、SOC1等），進而抑制植物的開花過程［24-26］。LHY蛋白是擬南芥生物周期節律的一個關鍵組分，能夠根據外界光照和溫度的變化調節細胞的生物學活動和植物體的生理適應。SINAT5介導LHY（late elongated hypocotyl）蛋白的泛素化降解，進而調節擬南芥的開花時間［27-29］。研究還發現，光信號的傳導蛋白DET1（DE-ETIOLATED1）可以抑制SINAT5對LHY的泛素化降解。因此，SINAT5通過對靶蛋白的泛素化降解建立了光周期與植物開花時間的聯系，對植物的生長發育特別是由營養生長向生殖生長的轉變發揮重要作用。

擬南芥SINA E3泛素連接酶基因家族有5個成員，SINAT2是擬南芥中第二個被發現的SINA E3泛素連接酶基因，也參與了擬南芥正常生長發育的調節過程。Welsch等［30］研究發現，SINAT2通過與RAP2.2（乙烯響應元件結合蛋白轉錄因子）互作，影響擬南芥類胡蘿卜素的合成。油菜素內酯（BRs）是一類新型的廣譜植物生長調節劑，參與調節植物的營養生長、生殖生長、種子發芽以及衰老等一系列的生長發育過程［31］。BRI1-EMS-SUPPRE SSOR 1（BES1）是BR信號通路中一個重要的轉錄因子，調節BR信號下游基因的表達［32］。擬南芥5個SINA E3均能與BES1互作，促進光下BES1的降解，抑制其下游基因的表達，從而光下植株下胚軸的伸長生長被抑制［33］。相反，在黑暗條件下，SINAs發生自泛素化降解，BES1蛋白正常發揮生物學功能，促進植株下胚軸的伸長生長。同時，該研究還發現，SINAs光下積累量增加，反之減少，BES1含量也隨之發生變化［33］。因此，表明SINA E3通過介導BES1的降解，連通了光信號和BR信號，調節了植物的光形態建成。Wang等［20］研究發現超表達SlSINA2轉基因番茄的葉片顏色變淺，葉綠素含量降低，植株生長發育遲緩，嚴重影響了番茄正常的生長發育，還發現超表達SlSINA5轉基因番茄的花發育出現異常，花萼、花瓣、雄蕊以及整朵花均不同程度地變小，但具體的作用機制還有待進一步探究。因此，不同的SINA E3通過靶向介導各種各樣靶蛋白的降解，調節植物復雜多樣的生長發育過程。

2 SINA E3泛素連接酶在植物響應逆境脅迫中的功能

隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發現，SINA E3除了調節植物生長發育外，還參與了植物對多種逆境脅迫的響應。植物中第一個被發現參與逆境脅迫響應的SINA E3是水稻（Oryza sativa）的OsDIS1（Oryza sativa drought-induced SINA protein 1）。2011年Ning等［34］篩選獲得受干旱誘導表達的OsDIS1，OsDIS1抑制了水稻的抗旱性。隨后，Ning等［35］進一步研究發現OsDIS1通過與OsSKIPa（干旱和鹽脅迫的正調因子）互作，影響了下游脅迫應答響應基因的表達，進而調節水稻的抗旱性。

與水稻SINA E3功能恰恰相反，AtSINA2提高了擬南芥的干旱脅迫抗性，超表達AtSINA2后，轉基因擬南芥的抗旱性明顯增強。進一步研究發現，干旱條件下AtSINA2促進ABA介導的植物葉片氣孔的閉合，降低水分散失，進而提高了轉基因植株的抗旱性［36］。與擬南芥 5 個 SINA E3（SINAT1-SINAT5）相比，AtSINA2（也被稱為SINAT6）的N端含有一個不完整的RING結構域，認為與SINAT5DN一樣，AtSINA2沒有E3泛素連接酶的活性，競爭性抑制了活性二聚體的產生，因此，發揮了與OsDIS1截然相反的作用［36］。然而，2018年Chen等［37］研究發現，AtSINA2蛋白N端的B-box結構域彌補了不完整的RING結構域，使其仍具有E3泛素連接酶的活性。同時，該研究還發現AtSINA2可以與CDKG1（細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶G1）互作，而CDKG1對AtSINA2的磷酸化直接影響了AtSINA2的穩定性，進而調節了植物體對ABA和滲透脅迫的響應［37］，表明SINA E3調節其靶蛋白穩定性的同時，其自身的活性功能同樣受蛋白的磷酸化和去磷酸化調節，因此，SINA E3發揮功能的機制復雜而多樣。ICE（INDUCER OF CBF EXPRESSION）是一類MYC型bHLH轉錄因子，目前，ICE-CBF-COR轉錄級聯途徑是已知植物體中重要的冷脅迫響應信號途徑［38］。2017年，Fan等［22］研究發現香蕉SINAE3還參與了植物對冷脅迫的響應，發現MaSINA1通過泛素化降解轉錄因子MaICE1，進而抑制MaICE1下游冷脅迫重要調節因子MaNAC1的表達，調節植物對冷脅迫的應答響應。

ABA是所有植物激素中最重要也是作用最廣泛的一種激素，其處于植物對非生物脅迫應答調節的核心，被稱為“植物逆境激素”。AtSINA2通過調節由ABA介導的氣孔閉合而提高植物的抗旱性［36］。2020 年 Li等［21］發現蘋果 MdSINA2 可以被ABA誘導表達，超表達MdSINA2轉基因蘋果愈傷和擬南芥均表現出ABA敏感，說明與AtSINA2一樣，MdSINA2參與了ABA信號調節植物對干旱等多種逆境脅迫的應答響應［21］。同時，蘋果SINA E3還調節植物對營養元素匱乏的響應。2020年，Xia等［39］發現超表達SINAT1、SINAT2、SINAT3和SINAT4的轉基因植株對ABA的敏感性增加，SINATs通過泛素化降解FREE1和VPS23A（蛋白運輸的胞內分揀復合體的關鍵組分），解除它們對ABA受體PYR和PYL4的抑制作用，進而參與植物的ABA信號傳導。當植物體中ABA含量升高，SINATs受誘導含量升高，與FREE1和VPS23A發生互作，將其降解，此時ABA的受體被釋放發揮作用，啟動ABA的傳導及響應基因的表達，植物體表現出對ABA的應答響應。

3 SINA E3泛素連接酶在植物與其他生物互作中的功能

植物固著生長的特性使植物被動遭受外界環境的各種有利因素和不利因素的影響，SINA E3不僅調節植物在適宜條件下的生長發育，同時也參與植物對各種不利環境條件的應答。當外界環境營養條件匱乏時，植物一方面通過改變根系的構型，盡可能多地從外界土壤中吸收養分；另一方面，植物利用根系與土壤中各類生物建立共生關系來吸收養分［40］。在根系的構型方面，SINAT5通過影響根毛的多少來發揮作用。SINA E3在植物根系與土壤中各類生物相互作用中也發揮著重要作用。

den Herder等［18］發 現 異 源 表 達 SINAT5和SINAT5DN的苜蓿，不僅影響了它的正常生長發育，同時也影響了根毛與根瘤菌之間的相互作用，抑制了根瘤菌與根毛形成穩定的共生關系和共生結構。共生類受體蛋白激酶（symbiosis receptor-like kinase，SYMRK）是微生物信號分子刺激植物根細胞后，植物體進行共生信號傳導的關鍵組分［41］。2012年，den Herder等［19］發現百脈根中的LjSINA4 E3可以與SYMRK互作，并且超表達LjSINA4后，SYMRK蛋白含量降低，抑制了與微生物進行互利共生信號的傳導，進而抑制了百脈根與根瘤菌的相互作用。

SINA E3除了參與植物與共生微生物之間的相互作用外，還參與了植物與病原微生物之間的相互作用。2016年Miao等［42］發現番茄SlSINA3可以將轉錄因子SlNAC1泛素化降解。SlNAC1是番茄脅迫相關NAC轉錄因子，可以被病原微生物假單胞菌（Pseudomonas）誘導表達，是植物防御病原微生物侵染的有效策略。當煙草SlNAC1同源基因被抑制表達后，煙草對假單胞菌的敏感性明顯增強［43］。超表達SlSINA3后，抑制了阻力蛋白R（resistance）蛋白誘導的超敏反應（hypersensitive response，HR）。因此，SlSINA3通過翻譯后水平的調節作用，抑制了番茄對病原微生物的防御反應。除了SlSINA3以外，番茄其他SINA E3也參與了番茄對病原微生物的防御響應。其中，SlSINA4可以激活細胞中防御相關信號的傳導，促進植物體對病原微生物侵染的應答響應。與SlSINA4不同，SlSINA1、SlSINA2、SlSINA5和SlSINA6則是通過降解R蛋白下游的相關組分，發揮與SlSINA3相同的功能，抑制植物對病原微生物的防御響應［43］。因此，面對外界病原微生物的入侵，植物體中不同SINA E3發揮著各自不同的作用，有的相互協同發揮作用，有的相互拮抗發揮作用，共同調節植物體對病原微生物的響應。

4 SINA E3泛素連接酶在植物細胞自噬中的功能

與UPS對細胞中蛋白平衡調節作用一樣，細胞自噬（autophagy）是細胞中另一個重要的蛋白平衡調節系統。其中，UPS是對壽命較短、錯誤折疊以及受損傷蛋白的主要降解途徑，細胞自噬主要負責清除大的胞質組分，包括聚集的蛋白、喪失功能的細胞器和侵入的病原菌［39］。兩個蛋白平衡調節系統分別發揮不同的作用，又保持著千絲萬縷的聯系。如前所述，SINA E3通過泛素化調節植物BR信號途徑BES1轉錄因子的穩定性，進而參與植物的光形態建成［33］。同時還發現SINAT2可以與泛素結合受體蛋白DOMINANT SUPPRESSOR OF KAR 2（DSK2）直接互作，參與BES1-DSK2-ATG8復合體的構成，介導BES1經細胞自噬途徑的降解，表明植物在逆境脅迫和N或C元素缺乏的條件下，SINA E3可以通過同時激活泛素蛋白酶途徑和細胞自噬途徑對BES1的降解［33］。因此，SINA E3在細胞自噬過程中具有抑制植物在逆境下生長發育，提高植物抗逆性的作用，維持了植物在逆境條件下生長和抗性能力的平衡。

2017年，Qi等［44］研究發現SINAT1、SINAT2和SINA2均可直接與細胞自噬相關蛋白ATGs發生互作，參與細胞自噬過程的調節。SINAT1/SINAT2和SINA2在調節細胞自噬方面發揮著相反作用，當植物體的營養條件良好時，SINAT1和SINAT2促進ATG6蛋白的泛素化降解，抑制細胞自噬；當營養條件匱乏時，SINA2被誘導表達，發揮相反作用，抑制ATG6的泛素化降解，促進細胞自噬［44］。同時研究還指出，SINAT1和SINAT2在調節ATG6方面具有一定程度的功能冗余。因此該研究表明，植物體中SINA E3對細胞生命活動的調節精準而多樣，不僅可以通過UPS途徑直接發揮作用，同時也可以通過間接影響與UPS平行的其他調節途徑來發揮作用，實現了功能的進一步強化。而對于每一個SINA E3及其家族成員具體的生物學功能還需要更深入細致的研究和探索。2020年，Qi等［45］再次發現SINAT1、SINAT2和SINA2還可以與自噬相關蛋白ATG13互作。ATG13通過與ATG1互作形成蛋白激酶復合體調節自噬小體的形成，進而調節植物細胞自噬的過程［46］。植物體在不同的營養條件下，就是通過SINAT1、SINAT2和SINA2調節ATG1和ATG13復合體的穩定性，調節了細胞自噬過程，進而決定植物在不同營養條件下的應答響應。綜上所述，ATGs是細胞自噬的關鍵組分，在細胞自噬中發揮重要作用。SINA E3通過調節ATGs的穩定性，間接參與了細胞自噬［47-49］。因此，UPS和細胞自噬是細胞中兩個非常重要的蛋白平衡調節系統，兩者彼此獨立同時又相互依存，SINA E3的存在介導了兩個系統之間千絲萬縷的聯系，UPS通過SINA E3實現了對細胞自噬的調節和影響，同時細胞自噬也通過SINA E3實現了自身功能的完善和強大。

5 總結與展望

SINA E3是一類重要的E3泛素連接酶，通過調節細胞中不同信號通路上游的轉錄因子或蛋白激酶等調節蛋白發揮生物學功能，作用廣泛而深入。他的調節作用賦予了植物面對外界復雜環境條件“文武之道，一張一弛”的智慧。條件適宜時，植物正常生長發育；環境惡劣時，通過犧牲生長速度換取繼續活下去的能力；當有益微生物來臨時，調節微生物與植物的和諧相處進行互利共生；當有害微生物侵入時，將其限定在一定范圍內，防止其對植物進一步侵害。當然，植物中SINA E3的功能研究起步較晚，還有很多問題有待未來發現和探索。包括：（1）AtSINA2的E3泛素連接酶活性受其蛋白磷酸化狀態的影響，其他的SINA E3活性是否也同樣存在蛋白的翻譯后調節？（2）植物中SINA E3以同源或異源二聚體發揮作用的具體機制是什么？（3）動物中研究發現有的SINA E3可以以多聚體的形式發揮作用，植物中是否也存在相同的作用機制？（4）是否有更好的挖掘SINA E3互作蛋白的研究方法，進而更高效的研究SINA E3在植物體中重要的生物學功能。（5）為什么植物中大多數目前研究已知的SINA E3均發揮負調作用？不論是SINA E3蛋白自身的磷酸化，還是同源和異源二聚體的形成機制以及SINA E3通過蛋白與蛋白的互作靶向降解不同的靶蛋白（調節蛋白或者功能蛋白），均涉及到蛋白與蛋白的互作，因此在未來SINA E3功能的研究中需綜合利用多種蛋白互作的研究技術解決目前SINA E3功能研究中遇到的諸多問題，進而對植物中SINA E3功能進行進一步的挖掘和探索。SINA E3多樣化的功能也讓我們初步領略了植物體龐大復雜的調控網絡，為未來探索植物體中更多、更復雜的調節機制和功能途徑奠定基礎。