UPLC-MS/MS測定小麥莖稈木質素單體交聯結構的方法

孫淑芳 駱永麗 李春輝 金敏 胥倩

（山東農業大學農學院 作物生物學國家重點實驗室，泰安 271018）

木質素作為一種十分重要的可再生資源，受到越來越多的人關注［1-4］。但由于木質素的結構非常復雜，利用率極低。木質素是一種復雜的芳香族聚合物，由對香豆醇（p-coumaryl alcohol，H）、芥子醇（sinapyl alcoho，S）、松柏醇（coniferyl alcohol，G）3種單體通過不同的連接方式聚合而成［5-6］。木質素單體連接鍵包括 8-O-4、8-5、8-8、5-5、5-O-4、7-O-4等連接方式［7-10］。其中，8-O-4是最常見的，該鍵比其他鍵更容易斷裂［11］。另外，單體的比例不同，連接鍵的比例和種類不同。比如，富含G單體的木質素含有豐富的8-5、5-5、5-O-4鍵；富含S單元的木質素交聯度較低，提取的難度較小［12］。因此，確定小麥莖稈中木質素單體的交聯結構特性對木質素的開發利用尤為重要。

木質素的表征是木質素開發利用的關鍵。目前，主要采用溴乙酰法、Klason法、巰基乙酸法（thioglycollic acid，TGA）、酸性洗滌法測定木質素的含量，這些方法通過降解細胞壁和木質素，測定可溶性降解產物，從而獲取細胞壁中不溶性木質素的含量，但這些方法無法獲取關于木質素單體的相關信息［13-16］。堿性硝基苯氧化法是通過在樣品中加入硝基苯，經高溫條件反應后獲取木質素單體含量的方法，但是該方法無法提供木質素結構特性的相關信息［17］。紫外光譜（ultraviolet absorption spectrometry，UV）、紫外-可見-近紅外吸收光譜（UV-visible-NIR absorption spectra，UV-Vis-NIR）、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）是利用木質素官能團在不同位置的特征吸收峰對木質素進行定性分析，但不能提供木質素單體序列和交聯結構的精確信息［18-22］。

本研究通過使用不同比例的3種單體和過氧化物酶模擬木質素單體的自然聚合過程，在體外聚合形成木質素二聚體、三聚體等結構。同時，將小麥莖稈中的可溶性木質素溫和提取而不降解，利用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）分析其結構和含量。定性和定量分析小麥莖稈內可溶性木質素低聚體，更精確地測定小麥莖稈木質素單體交聯結構組成和含量，為木質素的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選用山農16的莖稈作為試驗材料。取拔節后14 d的小麥莖稈（用剪刀將莖稈最上部和最下部的莖節剪掉，留莖稈中部），液氮速凍后，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制 將3種單體（對香豆醇（H）、松柏醇（G）和芥子醇（S））混合（每種單體稱取3 mg）溶于2 mL含27 mmol/L的（CTA）2SO4磷酸鈉緩沖液（10 mmol/mL，pH 6.5）。加入 67 μL 3% H2O2和0.3 mg II型辣根過氧化物酶。30℃水浴1 h，用1 mL 5%的Na2S2O7水溶液中止反應。用0.6 mL乙酸乙酯萃取木質素單體和低聚物，再用飽和NaCl水溶液洗滌、渦旋振蕩2 min，4 727 r/min離心5 min，吸取上層清液，在真空濃縮儀中蒸干。最后，將干燥的樣品溶解在2 mL含有35%乙腈的水溶液中，等待上機。

1.2.2 樣品制備 樣品處理：稱取凍干的樣品粉末0.5 g，加入2 mL萃取劑（乙醇∶超純水=80∶20，V/V），振蕩混勻2 min。然后常溫條件超聲30 min。4℃4 727 r/min離心5 min，取上清。樣品殘渣中再次加入2 mL乙醇，重復上面的步驟，獲取上清液，將上清液放在真空離心濃縮儀中蒸干，然后加入2 mL乙酸乙酯溶解萃取木質素，渦旋振蕩2 min。4 727 r/min離心5 min，取上清，將上清液再次放入真空離心濃縮儀中蒸干，然后加入2 mL乙腈水溶液（乙腈∶超純水=35∶65，V/V）溶解，過0.22 μm有機系濾器，備用。

1.2.3 超高效液相-三重四級桿質譜條件 流動相A：超純水，流動相B：乙腈，梯度洗脫（0-0.5 min，95% A，0.5-3 min，95% A-75% A線性降低，3.0-3.5 min，75% A-10% A線性降低，3.0-4.0 min，10% A，4.0-4.1 min，10% A-95% A線性提高，4.1-6.0 min，95% A，表1）。色譜柱為 ACQUITY UPLC?BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，柱溫為 40℃。

表1 液相方法表Table 1 Liquid phase method

質譜條件為：MS系統：ACQUITY XEVO TQ-D，電離模式：電噴霧離子源負離子模式（ESI-）；源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：800 L/h，錐孔氣流速：30 L/h，碰撞氣流速：0.20 mL/min，毛細管電壓：負離子為2.5 kV；脫溶劑氣溫度：450℃；掃描模式：多反應監測MRM；霧化氣：氮氣。各木質素單體交聯結構的質譜參數見表2。

表2 各木質素單體交聯結構的質譜參數表Table 2 Mass spectrum parameters of crosslinking structures of lignin monomers

2 結果

2.1 定性與定量

圖1分別為UPLC分析標準品S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H、G（8-8）G的色譜圖。9種交聯結構的保留時間分別為 4.08、4.00、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min。圖2為實際樣品中9種木質素單體交聯結構的保留時間，分別為4.08、3.99、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min。可以確定樣品中檢測的木質素單體交聯結構分別為S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H和G（8-8）G。由于無9種交聯結構的商品化標準品，本試驗以50 μg/L芥子醛為基準，對樣品中木質素單體交聯結構進行定量（表3）。

表3 拔節后14 d小麥莖稈中9種木質素單體交聯結構的含量Table 3 Contents of crosslinking structures of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

圖1 UPLC分析標準品中不同交聯結構的色譜圖Fig.1 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analytical standards

圖2 UPLC分析樣品中不同交聯結構的色譜圖Fig.2 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analysis samples

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線的建立 由于無商品標準品，本發明制備的標準品為混合物，故以芥子醛為基準，對木質素單體交聯結構進行定量。配制0.05-100 ng/L的標準溶液，以峰面積（y）對芥子醛濃度（x，μg/L）作圖，回歸方程為：y=23.914 5x+131.997，相關系數（R2）=0.998 9。

2.2.2 樣品精密度 同一試驗樣品重復進樣（n=6），9種木質素單體交聯結構含量的平均值分別為0.03、0.04、0.55、0.05、0.29、0.03、0.05、9.79 和 0.15 ng/g。9種木質素單體交聯結構的RSD分別為2.10%、1.80%、0.57%、1.55%、0.87%、2.10%、1.93%、0.24%和1.28%（表4）。因此，該方法對9種木質素單體交聯結構的分析具有良好的精密度和重復性。

表4 拔節后14 d小麥莖稈中9種木質素單體交聯結構含量的精度分析Table 4 Accuracy analysis of crosslinking structure contents of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

2.2.3 加樣回收率試驗 測定樣品木質素單體交聯結構的含量，添加不同水平的標準品，測定樣品加標后每種木質素單體交聯結構的含量，計算回收率（表5）。回收率為91.67%-100%。

3 討論

木質素的高值、高效利用，對于人類的可持續發展具有十分重要的意義［23］。木質素是由木質素的3種單體（S、G、H）在酶的催化下聚合而成［24］。木質素單體交聯結構的表征，對于木質素的高值化利用意義深遠。有研究表明，高濃度稀釋的木質素單體溶液與緩沖的H2O2溶液緩慢混合后在辣根過氧化物酶的催化下，即可啟動成聚合過程［25］。本研究正是利用這一原理制備的標品。另外，本研究所使用的小麥莖稈前期處理方法，可以有效的去除莖稈中的色素、脂肪酸等基質干擾物質，降低檢測時樣品基質成分和目標化合物在電噴霧離子源進行離子化時相互競爭等的基質效應。

UPLC是具有小顆粒填料（＜ 2 μm）和超高壓系統（＞ 105 kPa）兩大特征的超高效液相色譜，具有更加高效和快速的色譜分離性能，由于其高靈敏度和精確度應用于越來越多的領域［26-27］。因此，利用UPLC-MS/MS測定小麥莖稈中木質素單體的交聯結構較為精確。前人研究表明，小麥莖稈中S和G單體的含量顯著高于H單體的含量［28-29］。本研究測得的小麥莖稈中木質素單體交聯結構主要以S和G單體間的連接鍵含量最多。證實了本研究的準確性。

4 結論

利用UPLC-MS/MS開發了一種定性定量分析小麥莖稈中9種木質素單體交聯結構的方法。該方法專一性強、靈敏度高、通量高，結果客觀易于分析。