水稻苗期致死突變體的鑒定及其基因定位

唐躍輝 趙雨凡 林錦 王胤 曹博遠 車怡帆 楊文杰 包欣欣 楊同文

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，周口 466001）

水稻（Oryza sativa L.）是世界最重要的糧食作物之一，從種子萌發(fā)、幼苗生長、分蘗至授粉結(jié)實的各個階段，均由各個基因協(xié)作調(diào)控來維持水稻正常生長發(fā)育。因此，挖掘和鑒定控制水稻生長發(fā)育進程中的功能基因，對植物生長發(fā)育和糧食安全都具有重要的意義。

蛋白質(zhì)合成是所有生物體必不可少的過程，mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯包括3個階段：起始、延伸和終止，每個階段都需要特定的輔助蛋白或因子參與［1］。在真核生物中，蛋白質(zhì)翻譯終止過程需要eRF1和eRF3兩類肽鏈釋放因子的參與，eRF1通過識別核糖體A位點的UAA，UAG或UGA終止密碼子并刺激新生肽鏈的釋放，導(dǎo)致mRNA翻譯成多肽的過程終止，eRF3通過水解GTP協(xié)助eRF1完成新生肽鏈的釋放［2-3］。研究表明，eRF1蛋白含有3個高度保守的域即N，M和C結(jié)構(gòu)域［4-5］。其中，N結(jié)構(gòu)域主要負責(zé)密碼子識別，且位于N結(jié)構(gòu)域中的NIKS和Y-C-F基序在N結(jié)構(gòu)域識別密碼子過程中扮演重要的角色，尤其是NIKS基序在eRF1與終止密碼子識別過程中起重要的作用［6］；M結(jié)構(gòu)域中的CGQ基序能夠結(jié)合tRNA的CAA末端，進而激活核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心的水解，在肽基-tRNA的肽釋放中起重要的作用［7］。近年來，eRF1功能的研究主要集中在動物，酵母和真菌中［8-10］，然而在植物方面的研究相對較少，僅僅在模式植物擬南芥中有少數(shù)報道。在擬南芥中，eRF1家族有3個成員，分別是AteRF1-1、AteRF1-2和AteRF1-3，這3個基因編碼蛋白不僅具有高度相似性，而且均具有肽鏈釋放因子的活性［11］。除此之外，AteRF1-1還參與擬南芥細胞伸長和胚根細胞分裂的調(diào)控，如共抑制AteRF1-1擬南芥植株表現(xiàn)為節(jié)間伸長減少，且共抑制AteRF1-1影響轉(zhuǎn)基因植株徑向細胞分裂［12］，然而AteRF1-2可以通過影響葡萄糖和植物激素應(yīng)答調(diào)節(jié)擬南芥生長發(fā)育，如提高AteRF1-2的表達增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對葡萄糖和多效唑（一種赤霉素合成抑制劑）的敏感性，且外施GA可以恢復(fù)植物的生長，相反，erf1-2突變體植株增加了對多效唑的抗性，表明AteRF1-2也許在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起負調(diào)控因子的作用［13］。

目前，eRF1家族基因在植物中的研究十分有限，主要集中于模式植物擬南芥，然而在單子葉植物水稻中已鑒定并明確功能的未見報道。

本研究以粳稻花之舞和T-DNA插入突變體為材料，通過Tail-PCR、Southern雜交、Northern雜交和石蠟切片分析，鑒定到一株T-DNA插入苗期致死突變體ls。并對OseRF1-1進行生物信息學(xué)分析和表達模式分析，為進一步分析OseRF1在水稻生長發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為粳稻花之舞和T-DNA插入突變體，種植在周口師范學(xué)院人工溫室。種子用1/1 000的汞消毒后，平鋪于含有濾紙和少量水的培養(yǎng)皿中，置于30℃催芽，發(fā)芽后移入水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)，2周后進行表型分析，并保存水稻第四片葉用于DNA和RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、ls突變體鑒定和Southern雜交采用美基生物植物快速DNA提取試劑盒（D3187，http://www.magentec.com.cn/）提取DNA，具體操作方法參照試劑盒說明書進行。設(shè)計3輪特異PCR嵌套引物（表1），利用Tail-PCR技術(shù)鑒定T-DNA插入突變體，具體步驟參考Zhao等［14］方法，Southern雜交所用 DNA需經(jīng) EcoR I、EcoR V、Hind III和Sac I（TaKaRa）酶切消化，具體操作參考Codner等［15］方法。

表1 本研究所需引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 ls突變體組織石蠟切片分析 選擇野生型和突變體植株葉鞘與分蘗節(jié)連接區(qū)域進行石蠟切片分析。先將材料切成0.5 cm小塊，用90 mL 70%酒精、5 mL冰醋酸、5 mL福爾馬林配置的混合液固定，抽氣30 min，固定24 h后用于后續(xù)試驗，隨后進行脫水、透明、浸蠟、切片，然后對石蠟切片進行硼砂甲苯胺藍染色5 min，用水洗干凈并置于37℃烘干，最后用二甲苯脫蠟20 min，2次，用加拿大樹膠封藏。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。試驗所需試劑及配置方法參考Yang等［16］方法。

1.2.3 RNA提取和Northern雜交 采用美基生物植物RNA提取試劑盒提取RNA，詳細步驟見說明書。利用地高辛Northern試劑盒（Roche）進行Northern雜交和探針合成，試驗所需封閉劑和抗體均由DIG熒光檢測試劑盒（Roche）提供。具體方法參考Zia等［17］方法。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN6.0軟件進行蛋白氨基酸序列分析，利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子量、等電點、疏水性等。

1.2.5 基因表達模式分析 選取粳稻花之舞2周齡幼苗的根、莖、分蘗結(jié)、幼葉和抽穗后7 d的老葉、穗和種子進行組織特異性表達分析。利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa）進行RT-qPCR檢測，所用儀器為ABI 7500 fast system。每個試驗3次生物學(xué)重復(fù)。以O(shè)sRUB1（Os06g0681400）為內(nèi)參基因，利用2-△△CT法計算基因相對表達量。

1.2.6 基因克隆與亞細胞定位 以水稻葉片cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴增OseRF1-1（不含終止密碼子）編碼區(qū)序列，將測序正確的序列經(jīng)Kpn I和Xba I酶酶切。與GFP融合構(gòu)建OseRF1-1-GFP融合表達亞細胞定位載體。以PEG介導(dǎo)的方法，將空載體和OseRF1-1-GFP融合表達載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細胞，16℃暗培養(yǎng)16 h，熒光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位情況，原生質(zhì)體的制備參考Tang等［18］方法。

2 結(jié)果

2.1 水稻苗期致死突變體表型分析

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)一株水稻苗期致死（seedling lethal）純合突變體，命名為ls突變體。與野生型植株相比，ls突變體植株在3葉期前沒有任何表型，但3-5葉分蘗期時，ls突變體植株迅速死亡（圖1-a）。表型分析進一步表明，與野生型相比，ls突變體首先從莖基部由下往上逐漸褐化壞死，然后植株脫水而死（圖1-b），通常在分蘗生長前l(fā)s突變體植株就已經(jīng)死亡。

圖1 野生型和ls突變體表型Fig.1 Phenotype of wild type and ls mutant

2.2 ls突變體組織石蠟切片分析

為了明確ls突變體導(dǎo)致苗期致死的原因，通過奧林巴斯SZX7體視顯微鏡對葉鞘與分蘗節(jié)相連部位進行觀察。發(fā)現(xiàn)ls突變體褐化區(qū)最早出現(xiàn)在葉鞘與分蘗節(jié)相連的泡沫狀組織中，然后向內(nèi)擴散，直至整個分蘗節(jié)壞死（圖2）。為進一步驗證試驗結(jié)果，對野生型和ls突變體分蘗節(jié)從下往上橫切面進行了石蠟切片分析。結(jié)果（圖3）表明，ls突變體葉鞘與分蘗節(jié)連接區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)破壞，分蘗節(jié)較下部位癥狀較嚴重，越向上癥狀越輕。

圖2 野生型和ls突變體葉鞘與分蘗節(jié)部位顯微鏡結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Microscopic structure analysis of wild type and ls mutants leaf sheaths and tiller node sites

圖3 野生型和ls突變體橫切面結(jié)構(gòu)Fig.3 Cross-sections of wild-type and ls mutant

2.3 ls突變體為T-DNA單拷貝插入突變體

選取ls突變體（至少600株雜合體后代）進行表型統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)正常表型與致死表型的比例為3∶1，因此，推測ls突變體可能是單隱性基因突變。為了明確T-DNA插入的拷貝數(shù)，用潮霉素序列作為探針進行Southern雜交試驗，結(jié)果（圖4）表明，EcoR V、EcoR I和Xba I酶切結(jié)果均出現(xiàn)一條帶，表明ls突變體基因組中只有T-DNA單拷貝插入。

圖4 ls突變體基因組DNA Southern雜交Fig.4 Southern blot of genome DNA in the ls mutant

2.4 ls突變體的鑒定

為了明確導(dǎo)致水稻苗期致死的基因，通過Tail-PCR技術(shù)對ls突變體T-DNA插入的位點進行了分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入在第1染色體Os01g0939500區(qū)域（圖5-a）。結(jié)果表明，ls致死突變體為eRF1-1（Os01g0939500）的T-DNA插入突變體。測序分析進一步表明，ls突變體T-DNA插入時，丟失了T-DNA的右邊界和NOS的終止子序列，導(dǎo)致GUS和eRF1-1融合轉(zhuǎn)錄，而GUS的終止密碼子仍然存在，因此eRF1-1不能進行正常翻譯（圖5-b）。為了進一步證實此結(jié)果，以GUS和eRF1-1序列設(shè)計探針進行Northern雜交試驗。結(jié)果表明，Northern雜交證明erf1-1中確實轉(zhuǎn)錄出GUS和eRF1-1的融合轉(zhuǎn)錄子（圖5-c和圖5-d）。

圖5 ls突變體中T-DNA插入位置分析Fig.5 T-DNA insertion site analysis of ls mutant

2.5 OseRF1-1的基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列分析

OseRF1-1（Os01g0939500） 序 列 分 析 發(fā) 現(xiàn)，OseRF1-1全長3 290 bp，不含內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄形成mRNA長1 311 bp，編碼436個氨基酸。氨基酸序列比對分析表明，水稻eRF1-1與小麥eRF1同源性為93.81%，與擬南芥eRF1同源性為87%，且水稻eRF1-1蛋白也存在NIKS、Y-C-F和CGQ保守基序（圖6）。以上結(jié)果表明，eRF1編碼的氨基酸序列在雙子葉植物和單子葉植物是高度保守的。

圖6 eRF1和其同源蛋白氨基酸序列分析Fig.6 Analysis of amino acid sequences of eRF1 and its homologous proteins

2.6 OseRF1家族基因表達模式分析

運用NCBI序列比對發(fā)現(xiàn)，eRF1家族在水稻中有4個成員，依據(jù)它們在染色體上的位置，分別命名 為 OseRF1-1、OseRF1-2、OseRF1-3和 OseRF1-4。為了進一步明確OseRF1家族基因的表達模式，運用 RT-qPCR技 術(shù) 檢 測 了OseRF1-1、OseRF1-2、OseRF1-3和OseRF1-4在根、莖、幼葉、老葉、分蘗節(jié)、穗和種子中的表達情況。結(jié)果（圖7）表明，水稻eRF1的4個拷貝都是組成型表達，其中，OseRF1-2、OseRF1-4表 達 量 高，OseRF1-1、OseRF1-3表達量很低，OseRF1-1在穗里表達較高，OseRF1-3在種子中特異表達。

圖7 OseRF1家族基因的表達模式分析Fig.7 Expression profile of OseRF1 family genes

2.7 OseRF1-1蛋白亞細胞定位分析

為了明確OseRF1-1蛋白的基本特性，構(gòu)建OseRF1-1-GFP融合表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細胞，進行亞細胞定位情況觀察。結(jié)果（圖8）表明，35S∷GFP對照載體在細胞任何部位都檢測到了綠色熒光信號，與此類似，35S∷eRF1-1-GFP融合蛋白在所有細胞中也檢測到了綠色熒光信號，結(jié)果表明，OseRF1-1蛋白定位于細胞核和細胞質(zhì)。

圖8 OseRF1-1的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of OseRF1-1

3 討論

eRF1和eRF3已被證實在蛋白質(zhì)翻譯過程中起重要的作用［19-20］。研究表明，核糖體在細胞核中完成組裝，然后在細胞質(zhì)中行使其蛋白翻譯的功能，eRF1和eRF3一起在核糖體中協(xié)同完成終止密碼子的識別與翻譯過程［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)OseRF1-1蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核，該結(jié)果與eRF1蛋白在細胞質(zhì)中完成蛋白質(zhì)翻譯過程相一致。

eRF1蛋白除了蛋白翻譯功能外，eRF1也在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［23-24］。如擬南芥eRF1-1的Cas9基因編輯突變體植株呈現(xiàn)出生長發(fā)育缺陷表型［23］；eRF1-2和ORANG互作調(diào)控擬南芥葉柄細胞伸長［24］；共抑制擬南芥eRF1影響轉(zhuǎn)基因植株細胞伸長和徑向細胞分裂［12］。在擬南芥中，eRF1-2也參與植物對葡萄糖脅迫的調(diào)控，在葡萄糖脅迫條件下，過表達eRF1-2植株呈現(xiàn)出種子發(fā)芽延遲和早期幼苗發(fā)育停滯表型［13］。本研究鑒定了一株T-DNA插入引起水稻幼苗致死ls突變體，ls突變體5葉期后分蘗節(jié)和莖基部連接處細胞逐漸壞死，且分蘗節(jié)越往下癥狀越嚴重，結(jié)果表明，ls突變體導(dǎo)致苗期致死可能是由于引起分蘗節(jié)下部位細胞死亡造成的。Tail-PCR和Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入到eRF1-1基因組，且GUS和eRF1-1融合轉(zhuǎn)錄然而GUS終止密碼子仍存在導(dǎo)致eRF1-1不能正常的轉(zhuǎn)錄，這說明ls突變體導(dǎo)致水稻苗期致死的原因可能是因為T-DNA插入eRF1-1導(dǎo)致該基因不能正常轉(zhuǎn)錄所造成的。

同源序列比對分析發(fā)現(xiàn)，eRF1基因在水稻中存在4個拷貝，且OseRF1-3在種子中特異表達，表明OseRF1-3也許在種子生長發(fā)育中起重要的調(diào)控作用，OeeRF1-2和OseRF1-4為組成型表達，推測這兩個基因也許在植物生產(chǎn)發(fā)育的整個進程中發(fā)揮重要的作用，有待進一步研究。綜上所述，本研究為進一步研究eRF1基因在水稻生長發(fā)育中的功能提供有價值的參考信息。

4 結(jié)論

鑒定了一個水稻eRF1-1的T-DNA插入突變體ls，該突變體在3-5葉期后呈現(xiàn)苗期致死表型。OseRF1-1在穗中高表達，且編碼一個定位于細胞核和細胞質(zhì)的蛋白。eRF1-1參與植物生長發(fā)育進程的調(diào)控。