三系雜交小麥混播制種對雜交種產量、純度及F1產量優勢的影響

孔德真 聶迎彬 徐紅軍 崔鳳娟 穆培源 田笑明

（新疆農墾科學院作物研究所/谷物品質與遺傳改良兵團重點實驗室，石河子 832000）

雜種優勢是自然界普遍存在的一種生物現象。三大主要糧食作物中，小麥雜種優勢利用還未在生產上大規模應用［1］。雜交小麥不僅在產量方面表現出優良的特性，還在籽粒和秸稈品質、抗逆性以及小麥灌漿速率等方面均優于雙親或對照小麥普通品種［2-3］。目前，在強優勢雜交組合選配方面取得了較大進展，二系雜交小麥中約1/10的組合超親優勢在20%以上［4］，云雜3號在生產示范中雜種優勢為11.4%-21.9%［5］；三系雜交小麥新冬43號在生產試驗中，較對照增產10.55%［6］。但是，雜交小麥制種成本高、雜交種的質量是制約雜交種大面積推廣的主要因素。目前，雜交小麥種子生產成本是常規小麥種子生產成本的2-3倍。如何提高小麥雜交種的生產效率，降低生產成本是亟需解決的問題。

混播制種將原有的制種程序簡化，使雜交小麥種子生產更加經濟高效［7］。通過對父、母本混播比例的研究發現，20∶80的混播制種產量高于50∶50行比制種，在父本混播比例從20%提高到35%或50% 時產量沒有明顯提高［8］。Koekemoer等［9］研究發現，混播制種比（20∶80）-（50∶50）的行比制種產量可增加46%-76%。混播制種由于雜交組合的不同，父本混摻比例對制種產量和純度有較大影響［10］。上述僅研究了單一增加父本比例對制種產量的影響，未對混播混收對制種產量和種子純度的變化進行研究。

SSR分子標記已經成功運用于小麥種子DUS檢測［11］，可進行多個小麥品種純度的檢測。Tiwari等［12］選用40個小麥雜交種和14個親本選用20個SSR分子標記，有8個標記在雜交種中表現出多態顯性位點。由此看出，SSR分子標記對雜交小麥雜交種和親本區分是有效的。小麥AL型不育細胞質來自普通小麥（Triticum aestivum L.）的變種（Alborubrum Korn）輝縣紅，AL取自變種拉丁名的兩首字母大寫。該不育系具有易恢復、無不良細胞質效應等特點。為此，開展AL型不育系混播制種和開發一套AL型三系雜交小麥雜交種純度SSR分子標記檢測方法是十分必要的。

與其它制種模式相比，混播制種具有容易實現大面積種子生產和較低制種成本，成為雜交小麥制種的首選模式［1］。但是，對異交結實不同的強優勢雜交小麥組合進行混播制種及相應種子純度檢驗研究報道較少。本研究采用3個異交結實率不同的強優勢雜交組合，對隔離條件下混播制種、雜交種純度，以及種植不同混播比例混收的F1雜交種產量變化進行了研究。旨在為建立一套高效、經濟的雜交小麥制種新體系，促進三系雜交小麥商業化應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料由新疆農墾科學院作物研究所小麥創新團隊提供。組合1：墾冬雜43（36A×2014AR5），不育系36A連續5年測定自然異交結實率平均為90%，株高比恢復系低6 cm；組合2：墾冬雜22（002A×99AR142-1），不育系002A連續4年測定自然異交結實率平均為63%，不育系穗穎殼白色，恢復系穗穎殼紅色，株高比恢復系低9 cm。組合新冬43號（18A×99AR144-1，2013年新疆維吾爾自治區審定命名），不育系18A連續3年測定自然異交結實率平均為73%，用于AL型三系雜交小麥種子純度分子標記檢測方程的建立。所有試驗材料的不育系和恢復系都由作物研究所小麥創新團隊自主選育。

1.2 方法

1.2.1 試驗地點和時間 試驗在新疆農墾科學院作物研究所科學試驗田內進行，分別對組合1和組合2在2018年和2019年9月按不同比例進行混播，第2年5月15日左右抽穗后給混播制種小區搭建全封閉隔離區（1.5 m高框架，400目尼綸網罩）。恢復系揚花期，采用電動吹風機在上午11點和下午17點分別人工輔助授粉一次，連續趕粉7 d左右。6月5日左右拆除制種小區隔離罩。全生育期水肥管理同大田保持一致。

1.2.2 混播制種田間種植方案 混播制種組合1和組合2采用5個小區制種處理，父本恢復系種子按照母本不育系種子粒數的3%、6%、9%、12%、15%的比例均勻混入不育系種子中，以父、母本3∶9行比制種作為對照小區，各小區制種面積為9.45 m2。每個混播制種小區種植18行，每行67粒，行長1.8 m，行距為0.25 m，成熟后混合收獲。行比制種小區為21行，中間3行播恢復系，兩邊各播9行不育系，成熟后僅收獲18行不育系上所結種子。

1.2.3 混播制種田間純度檢測方法 根據組合2恢復系成熟后穎殼為紅色的性狀特征，成熟后分別收獲和統計每個處理小區父本和母本的收獲穗數，計算制種區（F0）田間純度（F0田間純度%＝♀收獲穗÷田間總收獲穗數×100%）。然后分別脫粒母本穗異交（F1）和父本穗自交的收獲穗數和產量。

1.2.4 混播制種生產的雜交種產量測定 組合1和組合2各混播制種處理生產的雜交種和行比對照生產的雜交種進行田間產量比較。試驗采用隨機區組設計，每個處理6行，行距0.25 m，每行40粒，小區面積2.7 m2，2次重復。小麥成熟期，分別人工收割、脫粒，自然風干后測定產量。

1.2.5 雜交種分子標記純度檢測方法 以抽取純度100%的雜交小麥新冬43號種子1 400粒，等分成14份，每份100粒。其中7份人工混合恢復系種子，不同種子純度比例設計如下：100%，97%，94%，91%，88%，85%和82%，見表1。每種比例用四分法隨機抽取25粒種子，在穴盤上發苗，采用CTAB法［13］提取葉片DNA。利用本研究團隊前期開發的恢復基因（qRf-2A-1）連鎖的SSR分子標記Wmc474［14］對幼苗DAN進行PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳染色檢測［15］，分別統計各試驗處理雜交種和非雜交種子的檢測數量；將統計出的檢測值與設計理論值作相關性分析和回歸分析得到小麥雜交種純度計算值與檢測值方程。

表1 人為混入恢復系試驗設計Table 1 Artificial blended restorer line test design

1.2.6 產量表型數據獲取 組合2在小麥出苗期和收獲期統計每個混播制種小區的基本苗和總收獲穗數。根據父本穎殼標記性狀區分不同混播比例下父本收獲穗數、母本收獲穗數，田間總收獲穗數，分區分別人工收割父本和母本穗、脫粒，自然風干后稱籽粒重，然后稱取籽粒千粒重（2份取平均值）。F1種子純度（%）=（母本收獲粒數÷收獲總粒數）×100%。

1.2.7 數據處理 所有數據采用SPSS17.0的多重比較法（LSD法）進行統計分析和差異顯著性檢驗（P＜0.05）。用Microsoft Excel 2010軟件進行數據統計和作圖。

2 結果

2.1 混播不同比例恢復系對制種產量的影響

不同父本混播比例對小區混收制種產量有較大的影響。由表2可以看出，與對照相比不同混播比例隨著恢復系種子混摻比例逐漸增多，小區混收種子產量（含父本產量）表現出逐漸增加的趨勢。與行比制種對照相比，在混播比例為9%時，混播混收雜交制種產量達到2 037.98 g，與對照相比增產58.1%。隨著混播比例增大，雜交種產量占小區混收種子產量的比例逐漸減小，在混播恢復系比例為15%時，雜交種產量占小區混收種子產量比率為78.74%。在混播混收制種過程中，為使制種產量及種子純度均達到較高要求，組合1選用混摻6%的恢復系種子制種，混播混收制種產量較對照增產26.86%，雜種種子產量占比可達到89.07%。組合2的父本穗穎殼為紅色，與不育系穗穎殼白色可以明顯區別，分別統計父本和母本收獲穗數，可以精確估計制種小區（F0）田間種植純度與雜種種子產量。

表2 組合1混播不同比例恢復系對混播混收制種產量的影響（2018年）Table 2 Effects of different mixed sowing ratios of male parents in combination 1 on the yield of seed production via mixed sowing and mixed harvesting（2018）

由表3可以看出，組合2在混播不同比例恢復系種子制種中，制種小區（F0）的田間種植純度隨著混播比例的增大而減小，父本穗所占比率與設計混播比例的差異受田間出苗率的影響，也與恢復系成穗率較不育系低有關。當父本的混摻比例為12%時，混播混收制種小區田間純度為94.08%，雜交種的制種產量達到291.1 g，與對照相比增產146.7%。比較組合1與組合2制種產量的差異顯然與2個不育系的異交結實率相差近30%有密切關系。說明不育系的異交結實率是影響制種產量非常重要的因素。

由于制種試驗是在封閉隔離小區中進行，2個不育

系在授粉期對隔離小區內部高溫的耐受力有差異，

也是導致2年之間兩個組合制種收獲產量差異較大

的原因。

2.2 組合2混播比例對種子純度和產量的關系分析

由于全封閉隔離區小氣候原因，組合2不育系

異交結實率（平均3.58%，穗粒數5.74粒）顯著低

于自然條件下異交結實率（平均63%，穗粒數24粒），

抽穗后的隔離環境對成穗數沒有影響，籽粒形成期

撤除隔離罩對千粒重影響不大（表3）。因此，用隔

表3 組合2不同混播恢復系比例對雜交種制種產量的影響（2019年）Table 3 Effects of mixing ratio of male and female parents on the seed production yield of hybrid line in combination 2 （2019）

離條件下組合2不育系收獲穗數和千粒重與自然條件下不育系異交穗粒數模擬分析不同混播比例對產量和純度的影響（表4，圖1）。從圖1可以看出，混播混收制種與行比制種對照（CK）比較皆增產，種子純度隨混播比例增加逐漸降低，當混播比例為5%時，制種產量3.84 kg較對照3.63 kg增產5.78%，雜交種的純度為96.45%。目前，國家對雜交小麥種子純度沒有相關標準，參考雜交水稻和雜交玉米大田雜交種純度不低于96%的國家標準，組合2選用混播恢復系3%-5%時，雜交種的純度都可達到96%以上，但考慮制種產量，混播恢復系比例為5%時，制種產量和純度最佳。

圖1 不同混播比例對制種純度和產量的影響Fig.1 Influence of different blending ratio on seed production purity and yield

表4 組合2不育系按60%自然異交率和試驗收獲穗數測算制種純度和制種產量Table 4 Seed production purity and seed yield of the sterile line of combination 2 calculated based on the 60%natural outcrossing rate and the number of ears harvested in the experiment

2.3 不同混播比例的F1代產量比較

由圖2可以看出，2個雜交組合不同混播比例制種的F1產量較對照（行比制種）均有不同程度的提高。隨著混播比例的增大，雜交種的產量表現出先增大后減小的趨勢。組合1恢復系混播比例在12%時F1雜交種產量較對照增產6.49%，但未達到顯著水平；組合2在混播比例為9%時的F1雜交種產量最高，與對照比較增產33.2%達到顯著水平，其余混播比例的F1產量與對照比較未達到顯著水平；表明混播制種的F1代產量與對照比較沒有降低，甚至具有不同程度的提高。

圖2 不同混播比例對雜種優勢的影響Fig.2 Effects of different mixing ratio on heterosis

2.4 雜交種混雜不同比例恢復系種子SSR分子標記純度檢測

課題組前期采用復合區間作圖法在1BS染色體上檢測到與恢復基因相關的1個QTL 位點（qRf-1B-1），該QTL位點距離兩端連鎖SSR標記為Xbarc8和Xgwm413之間，2A染色體上與恢復基因相關的QTL位點位（qRf-2A-1）于Wmc474和Wmc198之間。利用恢復基因差異位點的SSR分子標記可進行恢復基因的分子標記輔助選擇，還可應用于AL型雜交小麥雜交種子純度檢驗［16］，加快雜交種純度檢測的速度。按表1的試驗設計和檢測方法，應用2A染色體上恢復基因的SSR分子標記Wmc474對新冬43號雜交種混雜不同比例恢復系種子分子標記純度檢測結果列表5。其中對混入12%恢復系種子（25粒被測種子中恢復系理論粒數為3粒）的電泳檢測如圖3所示，1號為雜交種雜合泳帶，2號為恢復系泳帶，9號、15號、25號3條泳帶為恢復系帶型，其余帶型為雜合帶型，將檢測結果x=3代入表5純度檢測回歸方程y=0.285 7+1.142 8x，y=3.71，1-（3.71÷25）×100得到85.16%檢測純度與表5所示理論純度88%結果基本一致。

圖3 采用Wmc474引物檢測混摻6%恢復系電泳圖Fig.3 Electrophoretic diagram of blend 6% restorer line detected by Wmc474 primer

表5 雜交種混雜不同比例恢復系種子分子標記純度分析Table 5 Molecular marker purity analysis of restorer mixed with different proportions of hybrid seeds

為驗證2個分子標記檢測結果的實用性，我們在隔離區，將新冬43號雜交種子與恢復系99AR144-1種子按85%∶15%比例混合播種。從收獲的種子中隨機抽取1 000粒種子，再用四分法隨機取25粒種子發苗，提取葉片DNA，利用前期1B染色體上與恢復基因連鎖的SSR分子標記XBarc8建立的回歸方程［17］進行了驗證，將檢測結果x=3代入引物XBarc8純度檢測回歸方程y=-0.145 2+0.931 4x，y=2.79，1-（2.79÷25）×100%得到88.84%，檢測純度與理論純度85%結果基本一致；表明用2個分子標記建立的2個回歸方程在混播恢復系制種的純度鑒別中均可使用。

3 討論

小麥雜交種制種產量和成本是制約雜交小麥大面積應用的主要因素。因此，建立一種簡易、高效、低成本的制種體系對于雜交小麥大面積推廣具有重要意義。混播混收制種可以使恢復系植株均勻的分布于不育系群體中，減小了小麥花粉在異交過程中的移動距離，增大了母本授粉概率，可以提高母本的異交結實率。宋喜悅等［10］研究發現，在父本0.5 m范圍內，母本異交結實率可達80%-90%，而距父本2-2.5 m范圍的母本異交結實率僅為30%-40%；龔德平等［18］采用混播混收制種方法對10個強優勢雜交組合進行混播制種研究，各組合混播混收制種產量均高于分播制種，平均增產幅度達到了13.4%。Whitford等［19］研究發現，在混播制種條件下，父本混播比率從20%增加到50%，制種產量從46%增加到76%。

上述僅研究了單一增加父本比例對制種產量的影響，未對混播混收對制種產量和種子純度的變化進行研究。我們的研究表明，不育系混播恢復系制種作為雜交小麥制種的一種方法，由于不同雜交組合之間母本的異交結實率存在較大差異，不同混播比例對產量和純度都有較大的影響。在混播混收制種過程中父本混播比例逐漸增大，母本結實率逐漸提高，混收種子產量逐漸增加，種子純度逐漸降低；在保證種子產量和純度的前提下，合理確定父、母本混播比例，將制種產量和純度達到最佳是至關重要的［1］。目前，國家對雜交小麥大田生產用種純度沒有相關標準，雜交水稻和雜交玉米大田用種國家標準為雜交種純度不低于96%（GB4404.1-2008）。本研究以此為參考，當不育系的自然異交結實率大于60%，父本恢復系的混播比例在3%-5%時雜交種純度大于96%，制種產量也高于行比制種，在生產中優選推薦5%為父本的混播比例。雜交種的產量不僅與制種方式有關還與母本不育系的異交特性密切相關。要選擇不育系柱頭外露率高、柱頭生活力強，株高較父本低10 cm以上，恢復系主要選擇花藥外露率高、散粉好、花期較長、株高比對應的母本高10 cm以上，可以顯著提高母本的異交結實率。

在雜交小麥種子生產過程中，雜交種純度檢測由傳統方法向分子標記指紋圖譜方法轉變。應用分子標記構建指紋圖譜篩選品種間的特異帶譜，為種子純度鑒定提供了一種更準確的方法［20］。本研究采用2A染色體上與恢復系基因連鎖的SSR標記Wmc474標記建立了純度檢測回歸方程，與在同一恢復系1B染色體上Xbarc8為標記建立的回歸方程y=-0.1452+0.9314x，r=0.9875**［15］相比較，兩個不同染色體上的恢復基因相關標記可以比較準確地對AL型雜交種純度進行檢測。

在混播混收制種過程中，收獲雜交種中混入了少量恢復系，對產量優勢及群體變化產生不同的影響。雜交種與父本恢復系在株高、葉型等多個農藝性狀之間存在差異，相當于兩個不同品種之間的混合播種。通過研究發現，具有不同形態、生理特征的小麥品種在單一種植條件下，往往出現病害、凍害等現象，從而影響產量。而不同品種混播能夠比較充分地利用光、溫、水、氣等自然資源，提高群體的穩定性和安全性［21］，宋喜悅等［10］對混入不同比例恢復系進行制種并對雜交種的雜種優勢進行研究發現在混合比例為17∶3（混入比例為15%）時，產量優勢達到最大，這與本研究在12%時雜交組合產量優勢較高的結果相近，但是他沒有考慮雜交種子純度下降的因素。混播混收制種生產的雜交種中混入部分父本可能導致F1代群體成熟期不一致，收獲時不能在最佳成熟期收獲。因此，針對雜交小麥混播混收制種強優勢雜交組合親本的選育，不僅需要在雜交制種產量和F1代產量上表現出較強的優勢，還需要注意選擇雙親在成熟期、株高基本一致，為F1田間表現的一致性和最佳收獲提供保障。雜交小麥混播混收制種不會因為父本恢復系混入而導致雜種優勢降低。說明科學合理的混播混收制種技術可簡化雜交小麥的制種程序，降低制種成本，在保證生產用種子純度標準的前提下提高制種產量，有利于雜交小麥的生產應用。

4 結論

在雜交小麥混播混收制種過程中，雜交組合母本異交結實率為63%-90%時，父本最佳混入比例分別為3%-5%，雜交種種子純度和產量均達到最佳。混入父本的比例隨著母本的異交結實率逐漸增大而減小；在不同混播比例條件下制種的F1代雜交種產量與對照比較沒有降低，甚至具有不同程度的提高；2個與AL型不育恢復基因連鎖的SSR分子標記可以比較準確地檢測混播混收制種產生的雜交種種子純度。