杧果鉀通道基因MiSPIK的克隆、表達與功能分析

韓蕾 李俊林 高愛平 黃建峰 李建召 宋志忠，，4

（1.魯東大學農林工程研究院 山東省高校作物高產抗逆分子模塊育種重點實驗室，煙臺 264025；2.中國熱帶農業科學院作物品種資源研究所，海口 571100；3.南京林業大學林學院，南京 210037；4.劍橋大學植物系，劍橋，英國 CB2 3EA）

鉀（K+）在農業生產中占有重要地位，土壤缺鉀制約作物產量和品質，如何提高作物鉀素營養高效利用是亟待解決和攻關的關鍵科學問題。果樹栽培中，控釋鉀肥能有效促進花的開放，改善果實品質和產量，增強采后貯藏性能［1-4］，相關研究集中在生理生化層面，而果樹鉀素營養高效與利用的分子機制尚不清楚。植物中，Shaker類K+通道介導K+吸收、地上部長距離運輸、分配和動態平衡，在植物生長發育過程中發揮重要功能［2，5-10］。然而，該家族通道功能研究集中在一年生模式作物，果樹中Shaker類K+通道的生物學功能依然未知。因此，研究果樹Shaker類K+通道的生物學功能，聚焦果樹研究前沿，具有重要的科學意義。

Shaker類型K+通道于1992年首次在擬南芥中報道，隨后陸續在不同植物中鑒定了30多個Shaker類型K+通道［11-12］。模式作物擬南芥中Shaker類型K+通道研究最為透徹，目前至少鑒定了9個Shaker類型K+通道，包括內向整流型（AtKAT1、AtKAT2、AtAKT1、AtAKT5和AtSPIK）、外向整流型（AtSKOR和AtGORK）、弱整流型AtAKT2和調節組件類型AtKC1［11-17］。其中AtSPIK主要在擬南芥花粉中表達，電生理功能研究證實其為內向整流型K+通道，在花粉萌發和花粉管形成中發揮作用，并通過SnRK1復合物調控進而參與柱頭上花粉的干燥過程［14，17］。AtSKOR主要在擬南芥根中表達，介導韌皮部K+分泌至木質部并經由“根-莖”的長距離運輸，該基因缺失突變后導致植株地上部K+含量降低約50%，電生理功能研究表明AtSKOR是一個電壓依賴型的外向整流型K+通道［16］。AtGORK在擬南芥保衛細胞中特異表達，該基因缺失突變后導致氣孔關閉受抑制，電生理研究表明AtGORK是電壓依賴型的外向整流型K+通道，其通道活性受蛋白激酶CPK33調節［13，15］。近年來，國內外學者在水稻［18］、荒漠植物霸王［19］、甜瓜［20］、山新楊［21］、紫皮柳［22］、沙冬青［23］等植物中陸續鑒定了Shaker類型K+通道蛋白。然而，果樹中有關Shaker類型K+通道的功能研究較少，近期研究表明梨PbrKAT1是一個內向整流型K+通道［7］，葡萄ViSKOR是一個主要在根中表達的外向整流型K+通道［24］。

杧果（Mangifera indica）是典型的熱帶果樹之一，其生長發育對K+的需求量較大，特別是花分化過程中對K+的依賴性最大［25-26］。然而杧果鉀素營養高效與利用的分子基礎尚未見報道，Shaker類型K+通道的生物學功能依然未知。

本研究以‘桂熱82’杧果為材料，克隆并鑒定了一個Shaker類型K+通道基因MiSPIK，分析其表達模式并初步明確其生物學功能，為研究杧果Shaker類型K+通道的生物學功能和熱帶作物鉀素營養與高效利用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

五年生‘桂熱82’杧果和一年生嫁接幼苗材料均由中國熱帶農業科學院作物品種資源研究所提供，野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0、農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株和植物表達載體pHB為魯東大學農林作物遺傳改良中心實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 利用一年生‘桂熱82’嫁接幼苗，按照李俊林等［23］和Song等［27］方法，以1/2 MS液體培養基為對照，進行缺鉀、50 mmol/L高鉀脅迫、4℃低溫脅迫、200 mmol/L NaCl和10% PEG處理。

1.2.2 植物總RNA提取和cDNA反轉錄 利用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，中國大連）試劑盒提取杧果不同組織材料的總RNA，微量紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度；根據Primescript 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中國大連）試劑盒，使用2 μg總RNA作為模板，使用oligo（dT）18作為錨定引物合成第一鏈cDNA。

1.2.3 利用RACE-PCR技術擴增MiSPIK 借鑒Song等［27］方 法 進 行 RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends-PCR）克隆目的基因MiSPIK。根據已報道植物Shaker類型鉀通道保守區域，設計簡并引物GP1-F和GP1-R（表1），以杧果花朵總RNA反轉錄的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因的保守區域序列。測序驗證正確后，分別設計用于3′-RACE和5′-RACE的特異性引物GP2-out/in和GP3-out/in（表1）， 利 用 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa，中國大連）開展 3′-RACE 和 5′-RACE 的巢氏PCR，然后拼接獲得目的基因MiSPIK的完整編碼區CDS序列；然后設計上下游引物，利用高保真酶High-Fidelity PCR（TaKaRa，中國大連）進行PCR擴增，PCR產物連到pMD19-T（TaKaRa，大連，中國）載體上，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

表1 本文所用引物序列Table 1 Primers used in study

1.2.4 生物信息學特征分析 通過TMpredict在線工具（http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預測MiSPIK蛋白的跨膜結構域。利用ProtParam在線服務器（http://expasy.org/tools/protparam.html）分析MiSPIK蛋白的化學公式、理論等電點（pI）、穩定性（instability index，不穩定指數＞ 40為不穩定蛋白），脂肪系數（aliphatic index，＜100為親水蛋白質）、總平均親水性GRAVY（grand average of hydropathicity，＜0為親水蛋白質）等理化性質。運用SignalP5.0在線服務器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預測MiSPIK蛋白的信號肽情況。利用Phyre2在線軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分析MiSPIK蛋白的三級結構。根據王力敏等［21］和Chen等［22］方法，利用ClustalX 2.0軟件對杧果、擬南芥、水稻、玉米、高粱、棉花、短柄草、大豆、番茄、黃瓜、桃、梨、葡萄、草莓、蘋果、番木瓜、克萊門柚、甜橙、香蕉、鳳梨、白楊、紅皮柳、巨桉和木薯24種已報道植物Shaker類型K+通道同源蛋白進行氨基酸序列比對［7，21-22，24］，利用 MEGA 13.0 中的最大相似法（maximum-likelihood）構建系統進化樹，分析遺傳進化關系。

1.2.5 表達模式分析 分別采集五年生‘桂熱82’杧果一年生新葉（4月1日）、新生韌皮部（4月1日）、新生根（4月1日）、盛開期花朵（4月1日，分為花瓣、花粉、花柱和花托）、幼果（5月1日）和成熟果實（8月1日）等材料，液氮冷凍后用于組織特異性表達特征分析。分別采集缺鉀、50 mmol/L高鉀脅迫、4℃低溫、200 mmol/L NaCl和10% PEG處理0、6、24和48 h時的葉片和根部材料，用于轉錄水平脅迫響應差異分析。

利用NCBI/Primer-BLAST在線服務器設計MiSPIK特異性表達引物（表1），以杧果MiActin為內參基因，利用SYBR Green熒光染料（TaKaRa，大連），通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀分析該基因的表達模式，反應程序為95℃ 30 s；95℃5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個 循 環 ；72℃ 10 s。在ABI 7500 PCR儀獲得相應的Ct值，經內參基因Actin 均一化處理，采用 2-ΔCt法計算相對表達量［21-24］。試驗共設置3次生物學重復，每次重復每個處理選用6棵幼苗。

1.2.6 超表達載體構建 設計特異性引物（表1），上下游分別引入Sac I和Xba I限制性酶切位點，PCR擴增帶有酶切位點的MiSPIK CDS片段，利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，大連，中國）將MiSPIK構建到植物表達載體pHB，獲得重組質粒pHBMiSPIK，并進行雙酶切驗證。

1.2.7 異源超表達的擬南芥轉基因株系創制 利用農桿菌介導的花序侵染法，將重組質粒pHB-MiSPIK轉化野生型擬南芥Col-0，將收獲的T0代種子在含有10 mg/L潮霉素的1/2 MS固體培養基平板上，篩選能夠長出綠色真葉、根系較長的陽性抗性苗并移栽到基質中，通過RT-PCR驗證擴增獲得一條2.4 kb的MiSPIK條帶。收獲T1代轉基因株系種子，在1/2 MS固體培養基平板播種10 d后觀察生長情況。

根據Song等［27］方法，利用電子天平稱量擬南芥生物鮮重，借助Epson Rhizo scanner（Seiko Epson，日本）掃描擬南芥的根系，并利用Epson WinRHIZO（Seiko Epson，日本）軟件分析總根長。利用HNO3-HClO4法消解植物組織材料，運用電感耦合等離子體原子發射光譜儀（ICP-AES）測定K+含量。

1.2.8 數 據 分 析 采 用SPSS 13.0軟 件（SPSS Chicago，美國）對全文數據進行顯著性分析，在對照和脅迫處理條件下2個獨立樣品間進行t檢驗（檢驗水平 *P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結果

2.1 MiSPIK的克隆

從杧果盛花期花朵里擴增得到一條485 bp的保守區片段（圖1-A），測序獲得堿基序列，其翻譯蛋白經BLAST比對，顯示是與擬南芥AtSPIK同源性最高的基因片段。根據已獲得的保守區序列（485 bp），開展 3′-RACE 和 5′-RACE，分別擴增獲得 3′端1 836 bp和5′端1 217 bp的產物（圖1-B），拼接獲得一條2 415 bp的全長CDS序列（圖1-C），將其命名為杧果MiSPIK。利用PCR擴增該基因的CDS序列并經測序驗證，功能域分析表明MiSPIK蛋白含有cAMP結合域（PF00027）、離子跨膜域（PF00520）和KHA（PF11834）等功能域，均屬于Shaker類型K+通道的典型功能域（圖2），提交NCBI獲得登錄號GenBank ID為OM179914。

圖1 MiSPIK RACE克隆過程Fig.1 RACE cloning process of MiSPIK

圖2 功能域分析Fig.2 Functional domain analysis

理化性質分析表明MiSPIK分子量為90 006.83 kD，pI為7.59，屬于含堿性氨基酸較多的蛋白。跨膜域預測結果表明，MiSPIK含有6個典型的跨膜結構域，不穩定指數為49.12，GRAVY值為-0.221，脂肪系數為88.91，表明MiSPIK屬于親水的不穩定膜蛋白。

2.2 系統發育樹分析

系統發育樹構建結果表明，24種已報道植物Shaker類型K+通道同源蛋白可以分為兩大亞族，其中，SKOR和GORK兩種外向整流型通道屬于GroupI，其余類型的通道均屬于Group II（圖3）。相較于Shaker類型其他通道蛋白，MiSPIK與梨PbrSPIK和擬南芥AtSPIK在進化關系上的遺傳距離最近（圖3），三者的氨基酸序列一致性最高，達到了59.46%（圖4），且擁有相似但仍有略微差異的三級結構（圖5），相較于擬南芥AtSPIK，杧果MiSPIK與梨PbrSPIK的三級結構更為相似。此外，同屬于禾本科（玉米、水稻、高粱和短柄草）、薔薇科（梨、蘋果和草莓）、楊柳科（楊樹和紫皮柳）或蕓香科（甜橙和克萊門柚）的SKOR同源蛋白傾向于緊密聚在一起。而禾本科（玉米、水稻和高粱）KAT同源蛋白傾向于緊密聚在一起（圖5）。

圖3 24種植物Shaker類型通道同源蛋白系統發育樹建立Fig.3 Phylogenetic tree construction of Shaker type channel homologs from 24 plant species

圖4 3種植物SPIK同源蛋白氨基酸序列一致性分析Fig.4 Identity analysis of amino acid sequence of SPIK homologs from 3 plant species

圖5 3種植物SPIK同源蛋白三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of SPIK homologs from 3 plant species

2.3 表達模式分析

RT-qPCR結果（圖6）表明，MiSPIK在花粉中特異表達，其轉錄水平的表達量最高，其次是盛花期整花中，而在一年生新葉、韌皮、根、盛開期花朵、花瓣、花柱、花托、幼果和成熟果實中的表達量相對較低，暗示該通道蛋白可能在杧果花粉發育過程中發揮重要作用。

圖6 組織特異性表達分析Fig.6 Tissue specific expression analysis

此外，MiSPIK在轉錄水平對不同非生物脅迫的響應情況存在差異。其中，缺鉀和NaCl脅迫在不同處理時間均顯著降低MiSPIK在幼苗根部的表達水平，高鉀脅迫在短期處理時間內（4 h時）顯著增強MiSPIK在幼苗根部的表達量，且在處理24 h時增強倍數最高，在處理48 h時的增加倍數則有所降低，而低溫和PEG脅迫則隨著處理時間的延長而持續增強MiSPIK在幼苗根部的表達水平（圖7）。

圖7 MiSPIK對非生物脅迫差異響應的熱圖分析Fig.7 Heat map analysis of differential responses of MiSPIK to different abiotic stresses

2.4 超表達轉基因擬南芥創制

根據圖8-A所示，構建重組表達載體pHBMiSPIK，利用農桿菌介導侵染法獲得T0代陽性轉基因株系，RT-PCR驗證顯示轉基因株系地上部和地下部均擴增獲得一條2.4 kb大小的MiSPIK的條帶（圖8-B），表明MiSPIK在轉基因擬南芥整株組織中均可穩定表達。

圖8 異源超表達轉基因創制Fig.8 Generation of heterologous over-expression transgenic seedlings

T1代種子在1/2 MS固體培養基平板上播種10 d后觀察生長情況。發現轉化MiSPIK的擬南芥地上部的生物量顯著高于野生型Col-0（表2），且提前抽薹和開花（圖9），然而，根系的生物鮮重和總根長均無顯著差異。T1轉基因擬南芥在整株（地上部和根部）的K+含量顯著高于野生型對照（表2）。

圖9 T1代轉基因株系表型分析Fig.9 Phenotype analysis of T1 transgenic lines

表2 T1代轉基因株系生理指標分析Table 2 Physiological indicator analysis of T1 transgenic lines

3 討論

K+是植物細胞中含量最為豐富的金屬元素，與植物的生長發育密切相關，土壤缺鉀將影響作物生長和發育，降低果實品質和產量［1-6］。目前，果樹中有關Shaker類型K+通道功能的報道極少，在梨［7］和葡萄［24，28］中有單個通道基因的功能研究。然而，SPIK通道的功能研究僅在模式作物擬南芥中有報道，果樹SPIK基因的生物學功能依然未知。

本研究通過同源克隆和RACE擴增技術，從杧果中克隆了一個在花粉中特異表達的Shaker類型K+通道基因MiSPIK，其編碼蛋白和梨PbrSPIK的三級結構較為相似，且具有較高的氨基酸序列一致性，兩者在在進化關系上遺傳距離最為相近，暗示二者可能具有類似的生物學功能。因此，解析杧果MiSPIK通道的功能，為研究梨和其他近屬植物SPIK同源基因的生物學功能提供了理論依據。

在生物學功能層面，SPIK通道屬于典型的Shaker類內向整流型K+通道，在擬南芥中介導花粉中K+的內流，與花粉萌發、花粉管形成和花粉表面干燥密切相關，這一生命過程受鈣調磷酸激酶CPK11 和 CPK24 的調控［14-15，17］。本研究借助轉基因擬南芥創制，初步證實異源超表達MiSPIK增強轉基因擬南芥整株K+的含量，促進轉基因株系提早抽薹和開花，但對根系發育無顯著影響，這些結果表明MiSPIK通道蛋白可能通過調節K+狀況參與花朵發育過程。盡管MiSPIK通道運輸底物K+的電生理功能及其調控機制還尚未清晰，但是轉基因株系中K+富集狀況的增強可能在一定程度上解釋了提早抽薹和開花的現象，即花朵中K+的富集可有效促進植物開花，這與宋志忠等［29］結果相吻合。

盡管在根中的相對表達量很低，但是MiSPIK的表達水平對不同非生物脅迫極為敏感且響應情況存在差異，缺鉀和NaCl脅迫顯著降低其表達量，而高鉀、低溫和PEG脅迫則顯著增強其表達量，這一發現與SPIK在其他物種中的報道結果相一致。這些結果暗示MiSPIK通道傾向于在較為適宜的K+供應環境中發揮作用（低鉀抑制，高鉀誘導），其生物學活性且在轉錄水平易受外界K+供應水平和低溫、PEG、NaCl等非生物脅迫的調控。這些發現與前人對于SKOR、GORK和KAT1等其他Shaker類型通道的研究結果相一致［7，18-24］，再次印證植物Shaker類型通道在K+動態平衡、質子調控和滲透調節中起關鍵作用。

綜上可知，花藥特異表達的K+通道基因MiSPIK可能通過維持K+動態平衡進而調控杧果花粉發育過程，借助本研究工作可為研究果樹SPIK同源蛋白的生物學功能提供理論支撐和技術借鑒。

4 結論

從杧果中分離并鑒定了一個Shaker類型的K+通道蛋白MiSPIK，與梨PbrSPIK和擬南芥AtSPIK具有高度同源性。MiSPIK在杧果花藥中特異表達，受缺鉀或NaCl處理的抑制均顯著降低，受高鉀、PEG和低溫脅迫誘導而顯著增強。超表達MiSPIK促進轉基因植株提早抽薹和開花。