黑果枸杞莖葉響應NaCl脅迫合成花色苷的轉錄組學分析

郭嬡 姜牧炎 哈力馬提·巴合太力 劉煜媛 王靜，2

（1.北方民族大學生物科學與工程學院 國家民委黃河流域農牧交錯區生態保護重點實驗室，銀川 750021；2.北方民族大學 經濟林遺傳改良創新團隊，銀川 750021）

花色苷是植物次生代謝產生的黃酮類色素，與植物而言，具有多種生物學功能。花色苷是植物主要的呈色物質，可吸引昆蟲傳粉受精［1］。植物能夠響應環境因子，如強光［2］、鹽堿［3］、溫度［4］、營養匱乏［5］等合成花色苷，以適應環境。長期強光照射可誘導植物合成花色苷，花色苷吸收了高能的光量子，保護飽和的光合電子傳遞鏈［6］。不利的環境往往導致植物直接或者間接遭受水分脅迫，花色苷還能夠作為滲透調節物質發揮作用［7］。花色苷具有極強的抗氧化能力，能有效清除多種脅迫產生的游離氧、氮自由基，有助于植物適應逆境脅迫［8-10］。擬南芥［3］、煙草［11］、假儉草［12］等，可響應鹽脅迫迅速合成花色苷，花色苷的合成量與植株耐受鹽堿的能力正相關。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生灌木，是世界上三大鹽堿性土壤的指示植物和先鋒植物之一，廣泛分布于我國西北荒漠地區，防風固沙能力強，耐鹽堿、干旱［13］。在漫長的進化過程中，黑果枸杞與環境相互作用，逐漸形成了許多內在生理和外在形態的適應對策［14］。目前，有關黑果枸杞響應鹽脅迫的研究主要集中于生理、生化指標的變化［15］；野生條件下黑果枸杞植株的功能性狀［16］、根際微生物與鹽堿環境的關系［17］；鹽脅迫后植株離子穩態的維持等方面［18］。黑果枸杞富含花色苷，相關研究更多集中于其藥理作用。從響應環境變化的調節因子角度，開展黑果枸杞植株中花色苷的合成、調控與鹽堿環境關系的研究尚不多見。

本研究以黑果枸杞植株為實驗材料，利用轉錄組測序（RNA-Seq）技術，研究NaCl脅迫下，黑果枸杞莖葉中基因的表達特性，分析并挖掘參與合成花色苷的基因，以期為深入理解黑果枸杞與鹽堿環境的適應機制提供理論依據，為黑果枸杞的引種馴化及品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用材料為北方民族大學植物培養室中培養的黑果枸杞扦插幼苗。

1.2 方法

1.2.1 NaCl脅迫處理黑果枸杞幼苗 選取扦插2周，長勢一致的黑果枸杞幼苗，分別移至對照及含有300 mmol/L NaCl的MS培養基表面［19］，培養5 d，觀察黑果枸杞幼苗的花色苷的積累變化，分別于第0、1、3、5 天測定花色苷含量。培養條件為28℃恒溫，光周期為光照12 h / 黑暗12 h，光照強度為4 000 lx。

1.2.2 花色苷測定方法 收集CK及NaCl處理后的黑果枸杞幼苗莖葉，稱重，按照0.05 g/200 μL比例，加入含1% HCl的甲醇溶液，置于4℃冰箱中，黑暗條件下抽提過夜。抽提結束后，加入150 μL ddH2O，150 μL氯仿，顛倒混勻，4℃ 12 000 r/min離心5 min；取200 μL上清液置于酶標板中，分別測定上清液在530 nm、657 nm的吸光度值，通過公式A530-0.25A657計算花色苷的相對含量。

收集CK及NaCl處理后的黑果枸杞莖葉，冷凍干燥。分別稱取干粉0.05 g，用0.5 mL甲醇/水/鹽酸（500∶500∶1，V/V/V）溶液，渦旋 5 min，置于 4℃抽提5 min，12 000×g離心5 min后，取上清液，經0.22 μmol/L濾膜過濾后用于LC-MS/MS分析。選用C18色譜柱分離（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流動相A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫，0 min B相比例為5%，6 min增至50%，12 min增至95%，保持2 min，14 min降至5%，平衡2 min。采用電噴霧離子源ESI（+），霧化器壓力35 psi，離子噴霧電壓5 500 V，掃描范圍（m/z）為50-1 500。

1.2.3 轉錄組數據測定及數據分析 選取扦插2周，長勢一致的黑果枸杞幼苗，分別移至對照及含300mmol/L NaCl的MS培養基表面，豎直培養3 d，剪取莖葉部分，液氮速凍，置于-80℃保存，用干冰將樣本運送至諾禾致源，測定各樣本轉錄組。對照及NaCl處理組各3個重復，分別記為CK1、CK2、CK3、Na1、Na2 和 Na3。

采用全式金的TRIzol Up提取各樣本中RNA，經DNase I消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度計檢測RNA的純度和質量；取1.5 μg的RNA經NEB Next Ultra RNA文庫制備試劑盒合成測序文庫，經Illumia TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS 生成Cluster后，在Illumina Hiseq platform 邊合成邊測序。

下機數據經錯誤率分布檢查，A/T/G/C含量分布檢查，測序數據過濾等獲得Clean reads，對Clean reads進行Trinity拼接，再經過Corset層次聚類，獲得Unigenes。

在此基礎上，篩選差異表達基因，以Unigenes的 fpkm（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，fpkm） 值 ＞ 0.3，Log2Nafpkm/CKfpkm≥0.5，Padj＜0.05，且3次生物學重復中均發生變化的基因為差異表達基因（DEGs），對篩選所得的差異表達基因進行GO注釋和KEGG通路分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR 隨機選擇12個差異表達基因，其中7個上調表達基因，5個下調表達基因，使用Primer Premier 5.0設計用于qPCR分析的特異性擴增引物，引物序列如表1所示，LrH2B1為內參基因。qPCR反應步驟：95℃預變性30 s，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，變性至延伸循環40次，結果采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。分析基因表達變化趨勢是否與轉錄組測序結果相符，檢測轉錄組測序的準確性。

表1 qPCR特異性引物列表Table 1 List of specific primers for qPCR

1.2.5 數據處理 試驗重復3次，采用Graph pad 5.0軟件對數據進行統計學分析并繪圖。

2 結果

2.1 300 mmol/L NaCl脅迫對黑果枸杞幼苗花色苷含量的影響

300 mmol/L NaCl可誘導黑果枸杞幼苗合成花色苷，隨著NaCl脅迫時間的增長，花色苷含量逐漸增多，結果如圖1-A、B所示，NaCl處理的第0、1天時，黑果枸杞幼苗嫩綠，無明顯的花色苷積累，NaCl處理的第3 天時，黑果枸杞幼苗的花色苷積累量顯著增加，相對含量為0.674，且花色苷主要集中在頂部葉片及莖部，NaCl處理的第5天，花色苷含量繼續增加，為0.893。可見，NaCl脅迫能夠促進黑果枸杞幼苗合成花色苷，并隨著NaCl脅迫時間的延長，黑果枸杞幼苗中花色苷的積累量逐漸增加，在NaCl脅迫處理的第5天時，花色苷含量最高。

圖1 不同時間NaCl脅迫下黑果枸杞幼苗中花色苷的含量Fig.1 Contents of anthocyanin in L.ruthenicum seedlings under NaCl stress at different times

黑果枸杞莖葉中，矮牽牛素3-O-蕓香糖苷是含量最高的花色苷。NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉中有3種花色苷和1種黃酮顯著升高，即飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷。其中，飛燕草素-3-O-蕓香糖苷含量升高的倍數最高，達11.9倍，矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷是含量最高的花色苷（5.313± 0.286）μg/g。結果如表2所示。

表2 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中顯著變化的花色苷種類及含量Table 2 Types and contents of significantly-changed anthocyanins in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

2.2 轉錄組數據質量分析

經轉錄組測序后，對照組CK1、CK2、CK3及NaCl處理組Na1、Na2及Na3共產生48.49 G數據，包含Clean reads 323 291 058條，Clean reads總數量在總測序數量的96%以上。單個堿基數錯誤率為0.02%、0.03%，均低于1%。評估測序堿基錯誤率的數值Q20大于96%，Q30大于91%，GC含量在42%-43%之間，統計數據如表3所示，表明轉錄組測序的質量符合要求，可用于后續分析。

表3 對照及NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉錄組測序數據信息Table 3 Transcriptome sequencing data of L.ruthenicum shoots under control and NaCl stress

2.3 差異表達基因的篩選

分析轉錄組測序數據，NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中共篩選到1 416個DEGs，其中上調的DEGs 867個，下調的DEGs 549個，上調DEGs的數目顯著多于下調DEGs的數目。

2.4 GO、KEGG功能注釋及富集分析

經GO注釋后，1 416個DEGs可聚類分為生物學過程、細胞組分和分子功能3大類。在生物學過程分類中催化活性、氧化還原反應活性及吡咯化合物的結合等具有較高富集頻次；在細胞組分中，光合的膜、類囊體部分、類囊體與光合作用相關的過程具有較高富集頻次；在分子功能中，單一有機體代謝過程、氧化還原反應過程、碳水化合物代謝過程等具有較高富集，說明這些過程在黑果枸杞莖葉響應NaCl脅迫中起著重要的作用，結果如圖2所示。

圖2 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉錄組差異表達基因GO富集分析Fig.2 Enriched GO terms of DEGs in L.ruthenicum shoots and leaves under NaCl stress

1 416 個差異表達基因經KEGG通路分析后，顯著富集（Q-value＜0.05）的通路有14個，結果如表4所示。其中光合作用-天線蛋白、光合作用、光合有機體的碳固定、鐵卟啉環及葉綠素的代謝與植物光合作用緊密相關；乙醛酸和二乙酸代謝、淀粉和蔗糖代謝2個通路與碳水化合物的穩態調節有關；苯丙素生物合成、黃酮生物合成、蠟質、角質生物合成、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成4個通路參與了植物次生代謝產物的調節；植物激素信號轉導通路也有差異表達基因顯著富集。由此推測，NaCl脅迫可能直接或通過植物激素調節黑果枸杞莖葉的光合作用、碳水化合物的穩態變化及多種次生代謝產物的合成與分解。

表4 KEGG顯著富集通路Table 4 KEGG enrichment pathways

2.5 花色苷生物合成通路基因分析

花色苷屬黃酮類物質，合成過程起始于苯丙素的生物合成途徑，因此，選擇苯丙素生物合成通路、黃酮生物合成通路及植物激素信號轉導通路3條通路深入研究。

苯丙素及黃酮的生物合成通路中，共涉及21個DEGs，其中有7個DEGs屬花色苷合成的結構基因，Cluster-45.113297（LrPAL）、Cluster-45.125726（Lr-C4H）、Cluster-45.245219（LrCHS）3個基因參與花色苷合成的早期過程，Cluster-45.100570（LrDFR）、Cluster-45.96209（LrF3H）、Cluster-45.242733（Lr-F3′H）、Cluster-45.156739（LrANS）4 個基因參與花色苷合成的晚期過程。NaCl脅迫后，7個基因的表達量均上調，結果如圖3所示。這些基因的上調表達與黑果枸杞莖葉中花色苷含量升高的表型緊密相關。

圖3 NaCl脅迫下黑果枸杞莖葉中參與花色苷生物合成的差異表達基因熱圖Fig.3 Heat map of DEGs related to anthocyanin biosynthesis in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

NaCl脅迫后，激活了黑果枸杞莖葉中多個植物激素的信號轉導通路，共有27個差異表達基因參與了脫落酸（ABA）、生長素、乙烯、赤霉素（GA）、細胞分裂素、水楊酸的信號轉導，結果如表5所示。其中，有15個差異表達基因參與了ABA的信號轉導，其中的14個差異基因表達量顯著上調。可見，在黑果枸杞莖葉響應NaCl脅迫過程中，ABA信號通路的調控發揮了重要的作用。

表5 NaCl脅迫下黑果枸杞莖葉中參與植物激素信號通路的差異表達基因Table 5 DEGs related to hormone signaling transduction pathway in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

2.6 轉錄因子的表達模式分析

NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉轉錄組中共有25類，87個轉錄因子表達量發生明顯變化，結果如圖4所示，位列前3位的轉錄因子家族是HB（調節蛋白）家族、MYB家族和AP2家族，分別含有的DEGs數量為13、11和10個。

圖4 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉錄組中轉錄因子聚類分析Fig.4 Cluster analysis of transcription factors in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

在花色苷合成的過程中，轉錄因子MYB、bHLH及WD40形成轉錄復合體MBW，調控花色苷合成通路中的結構基因，實現對花色苷合成的調節。轉錄組數據中，分別有11個MYB轉錄因子和5個bHLH轉錄因子發生顯著變化，這些轉錄因子的表達量如表6所示。NaCl脅迫后，MYB轉錄因子的表達量均明顯上調，其中表達量上調倍數最高的為Cluster-45.35768，表達量為對照的4.73倍，上調倍數最低的為Cluster-45.112186，表達量為對照的1.6倍。編碼bHLH轉錄因子的差異基因中，有4個基因表達量下調，1個基因表達量上調。

表6 表達量發生顯著變化的MYB和bHLH轉錄因子Table 6 MYB and bHLH transcription factors with significantly changed expression levels

2.7 轉錄組數據驗證

從分析獲得的差異表達基因中，隨機選取12個進行RT-qPCR的驗證，經驗證，與RNA-seq中基因的表達變化趨勢一致，結果如圖5所示。可見，RNA-seq的測序結果具有較高的準確性。

圖5 RT-qPCR驗證RNA-seq中差異表達基因Fig.5 Validation of DEGs in RNA-seq using RT-qPCR

3 討論

花色苷是調節植物生命活動重要的次生代謝產物，具有較強的抗氧化能力，在植物響應脅迫環境中發揮積極作用。NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉合成了大量花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高（5.313 ± 0.286）μg/g，NaCl脅迫后升高2.28倍。另外兩種花色苷，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素3-O-蕓香糖苷在脅迫后，分別升高7.5和11.9倍。在擬南芥pap1-D中，過量合成的花色苷能夠顯著提高植株對鹽脅迫的耐受能力［20］，轉了Del基因的煙草中，花色苷的含量升高與活性氧的清除能力呈正相關，并且增加了幼苗對鹽、干旱脅迫的耐受性［21］。由此推測，NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中花色苷含量的顯著增加，可能提高了莖葉抗氧化、抗鹽脅迫的能力。

分析對照及NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉錄組的變化，差異表達基因中有7個編碼花色苷合成的結構基因，均有不同程度上調，在葡萄［22］和紫雨樺［23］響應鹽脅迫過程的研究中，也得到了類似的結果，即花色苷合成通路基因的表達量與花色苷的合成具有正相關性。由此可見，黑果枸杞莖葉中花色苷合成通路基因的上調表達與花色苷含量升高的表型緊密相關。黑果枸杞莖葉中含量最高的花色苷種類為矮牽牛素，LrF3′5′H是調節矮牽牛素合成的重要基因［24］。分析轉錄組數據后發現，LrF3′5′H 的表達量并沒有顯著變化。查找LrF3′5′H在NaCl處理前后的表達量，發現該基因的表達量始終處于較高水平，推測F3′5′H較高的表達水平，催化了更多的黃烷酮生成二氫楊梅素，為矮牽牛素的合成儲備更多的前體物質。

植物能響應環境因子、營養元素變化調節花色苷的合成，這個過程可通過影響轉錄復合物MYB-bHLH-WD40（MBW）的表達量，調節參與合成花色苷的多個結構基因的表達而實現。擬南芥［25］和蘋果［26］，能響應低氮條件，通過上調AtPAP1（AtMYB75）、AtPAP2（AtMYB90）、AtTT8（bHLH）及MdMYB1的表達，調節花色苷合成通路中多個結構基因的表達，促進植物合成花色苷。蘋果經寒冷處理后可調節MdMYB1、MdbHLH3的表達量，調控花色苷合成通路結構基因的表達，進而合成大量花色苷［27］。經NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉中，有11個MYB轉錄因子及5個bHLH轉錄因子發生顯著變化，這幾個轉錄因子在黑果枸杞花色苷合成過程中的作用，將是后續研究的重點之一。

植物激素可直接調控或通過調控MBW的表達量間接調控花色苷的代謝過程。蘋果［28］、桑葚［29］果實成熟過程中，乙烯含量迅速升高，可直接作用于花色苷合成通路結構基因DFR及ANS啟動子上的乙烯響應元件，上調花色苷合成的基因表達，促進花色苷的合成與積累。ABA也能調控花色苷的合成。擬南芥經ABA處理后，花色苷含量增加，分析花色苷合成通路關鍵基因的表達量，AtDFR和AtANS顯著上調［30］。非呼吸越變型果實成熟時，施加外源ABA，可積累花色苷，加速果實著色，如藍莓、葡萄［31-32］。NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉轉錄組數據中有27個差異表達基因參與了植物激素的信號轉導過程。其中，參與ABA信號轉導通路的差異表達基因有15個。因此，ABA信號轉導通路的基因很可能在黑果枸杞莖葉響應NaCl脅迫，促進花色苷合成過程中發揮重要的調控作用，ABA信號轉導通路及與其他植物激素之間的交互調節過程有待深入研究。

綜上所述，NaCl脅迫可促進黑果枸杞莖葉合成花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高；通過二代測序技術分析黑果枸杞莖葉在NaCl脅迫后的轉錄組，結果表明，7個花色苷生物合成的結構基因顯著上調，參與植物激素ABA信號轉導通路的基因、多個MYB及bHLH轉錄因子表達量顯著改變。這些關鍵路徑基因的表達可能與黑果枸杞莖葉響應NaCl脅迫促進花色苷合成緊密相關。本研究的開展，為深入理解黑果枸杞與鹽堿環境的適應機制提供了實驗支撐；同時，從植株角度分析黑果枸杞花色苷合成的基因網絡，為黑果枸杞的引種馴化及品種選育提供了參考。

4 結論

NaCl脅迫能促進黑果枸杞莖葉合成花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高，推測植物激素ABA信號轉導通路基因、多個MYB、bHLH轉錄因子及花色苷生物合成通路結構基因的顯著變化與該過程緊密相關。