番茄青枯病發生對土壤真菌群落多樣性的影響

李婷婷 鄧旭輝 李若塵 劉紅軍 沈宗專 李榮 沈其榮

（江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室 江蘇省有機固體廢棄物資源化協同創新中心 作物免疫學重點實驗室 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

植物和土壤微生物之間的相互作用關系以及地上與地下所發生的反饋作用在控制生態系統過程和特性方面極其重要［1］。土壤微生物不僅可在元素循環、有機物分解和保持土壤肥力方面發揮關鍵作用［2］，還在促進植物健康生長方面有著重要影響［3-4］。土壤微生物區系是指微生物生物量、群落、多樣性等，它們對維持土壤健康和疾病抑制至關重要［5-6］。在現代農業系統中，高強度集約化或連續種植導致微生物群落多樣性減少、區系失衡、土壤有害微生物增殖，最終造成土傳病害的大規模爆發［7-9］。其中，設施蔬菜最為典型，如番茄連作后土壤微生物活性降低、土著有益微生物減少、病原微生物積累，最終導致連作障礙嚴重發生［10-13］。

青枯病是植物中最具破壞性的細菌性疾病之一，青枯菌（Ralstonia solanacearum）有廣泛的分布和宿主范圍，它入侵不同植物宿主的根部，并定殖木質部血管，導致嚴重的枯萎病，稱為青枯病［14-16］。過去大量的研究聚焦于土壤微生物組，如細菌［17］、真菌［18］、噬菌體［19］、原生動物［20］，乃至土壤線蟲［21］等對番茄青枯菌存活及青枯病發生的影響。與此同時，近年來的研究證實，青枯病的發生對土壤微生物與作物內生菌群的裝配有著較大的影響，如有研究發現［22］，罹患青枯病植株土壤微生物明顯不同于未患病植株土壤，其青枯菌豐度更高、多樣性下降、土著有益菌群種類與相對豐度雙低；還有研究［23］發現，青枯病發生時番茄根際與內生菌群組成與相互作用關系發生了較大變化，有益細菌種群與抵御青枯菌的侵染密切相關。然而，番茄青枯病發生后對土壤真菌群落影響的研究仍相對較少。

土壤有益真菌能夠幫助植物獲取營養以促進植物生長和健康［24］。而且土壤真菌能夠提高植物對土傳病原菌的抗性［25］。然而，土壤中細菌與真菌并不獨立存在，兩者之間常常相互作用，其相互作用關系對于土壤微生物生態系統功能的形成與維持十分重要［26］。如長期連作使得細菌與真菌互作網絡關系趨于簡單，且互作網絡逐漸轉變為真菌占主導地位［27］。真菌性病害如枯萎病的發生對土壤細菌群落的組成與多樣性有著重要影響［28］。健康土壤和青枯菌感染的土壤之間的土壤細菌群落組成與多樣性有差異［29］，但細菌性病害發生時其對土壤真菌群落的影響仍有待進一步研究。因此，本研究擬采集設施大棚內長期連作番茄田塊中罹患青枯病與未患青枯病的植株根圍附近的土體及根際土壤，利用熒光定量PCR和MiSeq高通量測序技術比較設施大棚內患病與未患病番茄的土體及根際土壤中真菌群落豐度與組成的差異，為闡明番茄連作土壤微生物區系的調控提供理論依據和方向支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點位于江蘇省南京是蔬菜花卉科學研究所（31°43′N，118°46′E），屬于亞熱帶季風氣候，年均溫度為15.4℃。供試土壤類型為黃崗土，土壤基本理化性質如下：pH 6.33、有機質23.56 g/kg、全氮1.89 g/kg、有效磷138 mg/kg、速效鉀464 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 本試驗于2015年2至6月在此設施大棚開展，此前已連續種植多季番茄，田塊已開始爆發土傳青枯病。試驗設置4個小區，每個小區面積10 m2。在種植番茄之前，施用7 kg雞糞有機肥（N+ P2O5+ K2O ＞ 5%）和0.5 kg復合肥（N-P2O5-K2O，15-15-15）作為基肥。施肥一周后，每個小區按照0.6 m × 0.6 m（株距×行距）的密度移栽番茄苗，每個小區約移栽32株。番茄生長期間視長勢追施尿素及氯化鉀，按照“少量多次”的原則使用滴灌設施進行水分管理。

1.2.2 土壤樣品采集 于番茄收獲期從每個小區隨機選取5株患病或者未患病的植株，用鐵鏟將距番茄莖部10 cm 以內表層土壤和根系一起挖取，將5株樣品混勻后運回實驗室內處理。輕抖根系，將附著根上的土壤抖落，連同土體土壤利用四分法保留約200 g土壤作為罹病番茄土體土壤（BD）和健康番茄土體土壤（BH）樣品，一份儲存在-80℃冰箱內用于后續的測序分析，一份在室溫下風干用于土壤理化的測定。將去除輕松附著土壤的番茄根系置入裝有150 mL無菌水的250 mL組培瓶，室溫下170 r/min振蕩30 min，振蕩后4 000 × g 離心 5 min，離心后沉淀即為根際土壤，將收集到的根際土壤混勻保存于-80℃備用，作為罹病番茄根際土壤（RD）和健康番茄根際土壤（RH）。

1.2.3 土壤DNA提取和真菌豐度的測定 采用土壤DNA提取試劑盒（DNeasy PowerSoil Pro Kit）按說明書提取并用核酸定量儀（NanoDrop 2000，USA）測定提取的土壤DNA核酸濃度。利用實時熒光定量PCR方法測定土壤樣品中總真菌的豐度［30］。擴增引物為 ITS（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 5.8S（5′-CGCTGCGTTCTTCATCG-3′）。將含釀酒酵母 18S全長的質粒進行梯度稀釋，采用ABI 7500熒光定量PCR儀，按照標準程序制成標準曲線。所有樣品進行3次重復，用ddH2O代替DNA模板設置為陰性對照。根據各樣品Ct值計算每克干土所含的拷貝數，取對數值，以log（copies/g dry soil）表示。

1.2.4 測序文庫構建與下機數據處理 參照Kozich等［31］發表的方法構建真菌測序文庫。真菌ITS擴增采用引物 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和 ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′）。所有PCR擴增、文庫準備及上機測序均在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。利用QIIME軟件對下機后的原始序列根據相應的barcode信息進行各樣品序列分配并去除接頭和引物序列。去除低質量序列后，參照Edgar［32］發表的方法，利用Usearch 11.0軟件對正反向序列進行拼接，生成操作分類單元（OTU）并挑選出各OTU代表性序列。利用RDP 11.4 classifier［33］將代表性序列與UNITE Fungal ITS trainset數據庫比對獲取各OTU分類組成信息。最后，對去除所有樣品中相對豐度均小于0.01%的OTU的數據進行后續多樣性分析。

1.2.5 數據統計分析 樣品抽平在R語言內后，基于97%相似度水平計算真菌群落豐富度Chao1指數及多樣性Shannon指數。基于Bray-Curtis參數計算各樣品主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）比較罹病與健康番茄土體和根際土壤中真菌群落結構差異。利用R中“vegan”包分析比較土壤類型與患病與否對真菌群落組成的影響。統計分析在 IBM SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）中完成，采用單因素方差分析、多重比較及獨立樣本t檢驗分析比較處理間的顯著性差異。單因素方差分析（ANOVA）假定方差齊性用LSD法，評估各處理之間的潛在差異（P ＜ 0.05）。

1.2.6 數據上傳 高通量測序的原始數據已上傳至NCBI數據庫，編號為PRJNA787090。

2 結果

2.1 罹病與健康番茄植株土壤中真菌的豐度

實時熒光定量PCR的結果表明（圖1），在番茄根際土壤中的真菌的豐度顯著高于土體土壤（P ＜0.001），而無論是土體和根際，罹病番茄土壤的真菌數量均顯著低于健康番茄土壤（P ＜ 0.01）。

圖1 罹病與健康番茄土體及根際土壤真菌豐度Fig.1 Fungal abundance in bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

2.2 罹病與健康番茄植株土壤中真菌群落的alpha多樣性

如圖2所示，無論是罹病還是健康番茄土壤中，土體土壤的Chao1指數與Shannon指數均顯著高于根際土壤（P ＜ 0.01）。在土體土壤中，罹病番茄土壤的Chao1指數顯著低于而Shannon指數顯著高于健康番茄土壤（P ＜ 0.05）；而在根際土壤中，罹病番茄土壤Chao1指數和Shannon指數均顯著低于健康番茄土壤（P ＜ 0.05）。

圖2 罹病與健康番茄土體及根際土壤真菌群落多樣性指數Fig.2 Diversity index for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and nondiseased tomato

2.3 罹病與健康番茄植株土壤中真菌群落的beta多樣性

如圖3所示，基于Bray-Curtis距離的罹病番茄和健康番茄土體、根際土壤真菌群落PCoA分析結果表明：罹病處理和健康處理番茄根際土壤在主坐標成分一（PCoA1）上明顯區分與土體土壤；罹病處理和健康處理在主坐標成分二（PCoA2）上明顯區分。進一步的PerMANOVA分析表明，土壤部位（土體和根際）以及番茄患病與否（罹病和健康）都是真菌群落差異的顯著性驅動因素（Adonis 檢驗，土體vs根際F = 8.17，土體vs根際P = 0.002；罹病vs健康F = 5.21，罹病vs健康P = 0.004）。

圖3 罹病與健康番茄土體及根際土壤真菌群落主成分圖Fig.3 Principal coordinate analysis（PCoA）for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

2.4 健康與發病番茄土壤真菌群落組成分析

由圖4可知，患病與未患病番茄土壤在目水平上組成相似，肉座菌目（Hypocreales）、糞殼菌目（Sordariales）以及被孢霉目（Mortierellales）是各處理相對豐度較高的優勢目，但處理間不同目的相對豐度存在一定的差異。在患病土體土壤中，被孢霉目、煤炱目（Capnodiales）的相對豐度顯著高于未患病土壤；在患病根際土壤中，煤炱目的相對豐度顯著高于未患病土壤（P ＜ 0.05）。

圖4 罹病與健康番茄土體及根際土壤真菌優勢目的堆積圖（a）和差異分析（b）Fig.4 Relative abundances of dominated orders for fungal communities in the bulk（a）and rhizosphere soils crop-ped with diseased and non-diseased tomato（b）

由圖5-a可知，在屬水平上，在土體土壤中共有295個屬，其中225個在罹病與健康番茄土體土壤中共存，健康土體特有的屬有13個；而在根際土壤中共有279個屬，其中201個在罹病與健康番茄根際土壤中共存，健康根際特有的屬有15個。無論是根際土壤還是土體土壤，與健康處理相比，罹病處理其土壤中尖刀鐮孢菌屬、鏈格孢屬（Alternaria）及Davidiella的相對豐度顯著增加（P ＜ 0.05）。此外，健康番茄根際土壤中木霉屬、頂孢霉屬、粘鞭霉屬的相對豐度顯著高于罹病番茄根際土壤（圖5-b）。

圖5 罹病與健康番茄土體及根際土壤真菌組成維恩圖（a）與部分優勢屬的相對豐度熱圖（b）Fig.5 Venn plot of fungal composition (a) and relative abundances heatmap (b) of partial dominated genera for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

如圖6所示，在OTU水平上，罹病與健康番茄根際土壤間組成差異較土體土壤更明顯，土體土壤中僅有3個OTU存在顯著差異，而根際土壤中有17個OTU存在顯著差異。與健康番茄根際土壤相比，罹患青枯病的番茄根際土壤中Pulchromyces OTU147、鐮孢菌屬OTU253、曲霉屬OTU317的相對豐度顯著增加，而粘鞭霉屬OTU84與OTU58、頂孢霉屬OTU209與OTU210以及被孢霉屬OTU381顯著減少（圖6）。

圖6 罹病與健康番茄土體（a）及根際土壤真菌OTU火山圖（b）Fig.6 Volcano plot of fungal OTUs in the bulk（a）and rhizosphere soils（b）cropped with diseased and non-diseased soils tomato

3 討論

根際是一個獨特的環境，在根際中病原體和有益微生物都會改變植物的生長和健康［34］。根際真菌群落能夠影響作物獲取養分以及作物對病原菌入侵的敏感性［35］。本研究利用高通量測序技術分析比較了連作番茄田塊中罹患青枯病以及健康番茄土壤的土體及根際真菌組成差異，深入揭示了土傳青枯病發生后土壤真菌群落多樣性與組成的特征。

病原菌的入侵能夠降低土壤微生物多樣性［36］，本研究也發現健康番茄土壤的多樣性高于罹病番茄土壤的多樣性，可能是因為在罹病番茄土壤中青枯菌的豐度增加，占據了更多的生態位，抑制了其它真菌的生存，導致了真菌多樣性降低。我們還發現罹病番茄土壤和健康番茄土壤中的真菌群落有著明顯的區別。

肉座菌目、糞殼菌目以及被孢霉目等是各處理的優勢目，這和李玉嬌等［37］的研究一致。肉座菌是一種土壤和葉面昆蟲病原真菌［38］，能夠控制番茄中的害蟲。本研究發現肉座菌目和糞殼菌目在健康番茄根際土壤的相對豐度高于罹病番茄根際土壤，而有研究表明糞殼菌目的相對豐度與發病率呈負相關［39］，可能是健康番茄土壤中肉座菌和糞殼菌的增加，減少了番茄中的害蟲，降低了發病率。

本研究發現青枯病發生后顯著降低了根際土壤中土著有益真菌粘鞭霉屬、被孢霉屬、頂孢霉屬和木霉屬的相對豐度，表明這些種群可能與土壤抑病能力有關。Zhang等［40］的研究報道了粘鞭霉屬具有促進植物生長的能力。被孢霉屬在有機農業和礦質土壤中有促進作物生長中的作用［41］，而且能夠抑制番茄枯萎病的發生［42］。有報道指出頂孢霉屬有利于生物修復［43］。木霉能夠產生降解病原真菌細胞壁的各種酶，如纖維素酶［44］，而且能夠產生一些次級代謝物，促進植物生長和植物防御，如harzianolide［45］和肽類［46］。木霉能夠在不同的條件下生存、繁殖能力高，能夠改造根際、對植物病原菌有很強的攻擊性以及能夠促進植物生長［47］。

由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病是一種典型的真菌土傳病害［48］。番茄通常患有由尖孢鐮刀菌［49］引起的枯萎病以及由青枯菌［50］引起的青枯病。研究發現番茄連作能夠導致青枯菌和尖孢鐮刀菌的豐度增加［51］。與王慶華等［52］研究結果相一致，本研究也發現在青枯病發生的番茄土壤中鐮刀菌屬的相對豐度顯著高于未患病番茄。賴朝圓等［53］研究表明，Pulchromyces與香蕉尖刀鐮孢菌正相關，與之類似，本研究發現罹病番茄土壤中Pulchromyces和鐮刀菌屬的相對豐度較健康番茄土壤中均顯著增加。

真菌和細菌同時存在于土壤環境中，真菌病害和細菌病害通常同時發生［26，54］。有研究表明土壤同時存在尖孢鐮刀菌和青枯菌，而且番茄枯萎病可能是由兩種病原菌引起，土壤細菌群落抑制兩種病原菌來控制枯萎病發生［55］。本研究也表明在青枯病害發生后的土壤中存在尖孢鐮刀菌。目前，我們的研究大多數都是在單一病原菌上，減少病原菌的方法大多是通過直接減少致病菌或者是調控土壤中微生物群落間接減少土傳病原菌［56］，但是抑制細菌和真菌病原菌的機制不同，能夠抑制細菌病原菌不一定能夠抑制真菌病原菌，相反能夠抑制真菌病原菌的不一定能夠抑制細菌病原菌，還有可能增加另一種病原菌。

微生物、土壤以及植物的互作關系復雜，病原菌入侵能夠影響植物地下部微生物群落的組成和功能，進而影響地上部植物的健康和生長。我們通過高通量測序技術分析了青枯病發生后土壤中真菌群落的變化，結果表明，相比于健康處理，青枯病發生后土壤真菌群落組成發現明顯變化，如多樣性降低，潛在土著有益真菌群（粘鞭霉屬、被孢霉屬、頂孢霉屬和木霉屬等）相對豐度顯著降低，而有害真菌鐮刀菌屬的相對豐度顯著增加。青枯病發生后真菌群落的演替規律、真菌與細菌的跨界互作關系變化將是未來研究的熱點與難點。

4 結論

青枯病的發生改變了番茄土體與根際土壤的真菌群落組成，患病番茄土壤真菌豐度、多樣性及土著有益真菌數量降低，而有害真菌數量增加。土壤中同時存在尖孢鐮刀菌和青枯菌，番茄枯萎病可能是由兩種病原菌引起，之后的研究要關注減少兩種病原菌。