高效液相色譜測定葡萄糖酸鈣片含量和溶出度的方法研究

鄧映明，張 雁，曾玉梅，劉志輝（通信作者）

（梅州市食品藥品監督檢驗所化學室 廣東 梅州 514071）

葡萄糖酸鈣片在臨床上廣泛用于補充鈣質，治療鈣缺乏癥，如骨質疏松、佝僂病[1-2]以及與其他藥物聯用用于產后出血、小兒厭食等[3-6]。葡萄糖酸鈣片現行標準為《中國藥典》2020 年版二部，其含量測定方法以鈣紫紅素為指示劑，EDTA 滴定液滴定至紫色轉變為純藍，滴定鈣的含量，換算為葡糖糖酸鈣的含量；溶出度采用原子吸收分光光度法測定其溶出量，原子吸收分光光度法重現性較差。現有文獻報道葡萄糖酸鈣含量測定方法主要包括電位滴定法、離子色譜法、ICP-OES、ICP-MS等[7-16]，本文基于高效液相色譜技術對葡萄糖酸鈣片的含量和溶出度測定方法進行了研究，建立了HPLC 法測定葡萄糖酸鈣片的含量和溶出度。該方法靈敏度高、不受輔料干擾、操作簡單、結果準確，且成本低，可為該藥品的質量控制提供參考。

1.儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀，Agilent 1200 紫外檢測器；SOTAX 半自動溶出儀；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。葡萄糖酸鈣對照品（批號100082-201002，含量：99.8%，中國食品藥品檢定研究院）；葡萄糖酸 鈣 片（廠 家A 批 號：2109031、2109012、2010014，廠 家B 批 號：77220503、77220203； 廠 家C 批 號：20211101、20210401，廠家D 批號：3220512、3220214、3220409，廠家E 批號：11220607 廠家F 批號：211201、210609、210104）。

2.方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1色譜條件與溶液制備 （1）色譜條件。色譜柱：安捷倫ZORBAXSB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（磷酸調節pH 至2.8），流速0.5 mL·min-1，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量：10 μL。（2）對照品溶液的制備。精密稱取葡萄糖酸鈣對照品55.30 mg 于2 5 mL 量瓶中，加水振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液。精密量取對照儲備液2 mL 置10 mL 中，搖勻，作為對照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取葡萄糖酸鈣片10 片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于葡萄糖酸鈣50 mg），置100 mL 量瓶中，加水30 mL，超聲10 min 使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。（4）陰性樣品溶液的制備。按葡萄糖酸鈣片處方比例（輔料為滑石粉、羧甲基淀粉鈉、蔗糖、硬脂酸鎂），制作除葡萄糖酸鈣外的陰性樣品，并按（2）項下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.2 實驗 （1）系統適用性實驗。取對照溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，按2.1.1 中的（1）項下色譜條件依次進樣，記錄色譜圖。結果顯示供試品溶液主峰保留時間與對照品主峰保留時間一致，理論塔板數以葡萄糖酸鈣峰計為15 000 以上。（見圖1）。（2）專屬性實驗。分別吸取上述供試品溶液、對照溶液、含輔料陰性樣品溶液，按照“2.2.1”色譜條件，記錄色譜圖。實驗結果陰性樣品溶液在與葡萄糖酸鈣相應的保留時間處，無色譜峰出現，表明輔料不干擾葡萄糖酸鈣的測定，見圖1。（3）線性關系與檢出限。①分別精密量取上述對照品儲備液0.5、1、2、5、10 mL 于1 0 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，配制成0.1103、0.2207、0.4414、1.1035、2.207 mg·mL-1的葡萄糖酸鈣系列標準溶液.②按2.1.1中的（1）色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以峰面積Y為縱坐標，系列標準溶液濃度X 為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程Y = 638.45X+9.0113，r= 0.9996。結果表明：葡萄糖酸鈣在0.1103 ～2.207 mg·mL-1范圍內與峰面積呈現線性關系良好。③量取對照溶液適量，加流動相逐級稀釋，以S/N = 3 時為檢測限。測得檢測限為3.8 ng，以S/N = 10 確定定量限為12.8 ng。（4）精密度試驗取系列標準溶液下濃度為0.220 7 mg·mL-1的對照溶液，按按2.1.1 中的（1）項下色譜條件連續進樣6 次，其峰面積平均值為309.1，RSD 為0.1%。（5）重復性試驗。取廠家B 樣品（批號：77220503）的葡萄糖酸鈣片，按（3）方法制備樣品進樣，平行測定6 次，平均含量為99.76%，RSD 為0.2%。（6）穩定性試驗。取廠家C 樣品（批號：20211101），制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12，24 h 后測定，葡萄糖酸鈣的峰面積RSD 為0.3%。試驗結果表明，供試品溶液配制好后24 h 內穩定。（7）回收率試驗。稱取已知含量的葡萄糖酸鈣片（批號：2109031，含量：947.12 mg/g）研細，稱取細粉適量（約相當于葡萄糖酸鈣20、25、30 mg 各3 份）置1 0 0 mL 量瓶中，共9 份，分別精密稱取葡萄糖酸鈣對照品（含量：99.8%，約20、25、30 mg 各3 份）置同一量瓶中，按含量測定方法測定含量，結果平均回收率為100.54%，RSD為0.74%。回收率試驗結果見表1。（8）樣品含量測定精密稱取6 各廠家14 批次的樣品細粉，按供試品溶液項下制備方法制備含量測定樣品，按照“2.2.1”項下色譜條件，進行含量測定，并與容量滴定法進行比對，結果顯示兩種方法含量測定結果相近，見表2。

表1 回收率試驗結果

表2 兩種方法含量測定結果比較（n = 3）

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 溶出度測定

2.2.1 測定方法 取葡萄糖酸鈣片6 片，溶出介質為水1 000 mL，漿法，轉速為每min50轉，溫度為37±0.5 ℃，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020 年版四部通則0931），依法操作，經45 min，取溶液適量，濾過，取續濾液作為溶出度測定供試品溶液。

2.2.2 累積溶出量曲線的繪制 取6 片樣品（批號：2109012），按“2.2.1”方法進行操作，分別于10、15、20、30、40、45、50、55 min 時取樣5 mL（同時補充溶出介質5 mL），濾過，取續濾液，按“2.1.1”色譜條件進樣，計算溶出量和平均累積溶出量，繪制累積溶出量曲線，測定結果表面45 min 后溶出曲線趨于平穩，樣品溶出量接近100%，見圖2。

圖2 葡萄糖酸鈣片溶出曲線

2.2.3溶出度均一性考察 取廠家A 樣品（批號：2109012），按“2.2.1”方法平行操作6 次，計算葡糖糖酸鈣平均累積溶出量，繪制其6 次溶出曲線，得溶出均一性結果，結果顯示，6 次溶出試驗的曲線趨勢基本相同，至45 min 時的累積溶出量RSD 為0.85%。見圖3。

圖3 溶出均一性結果（n = 6）

2.2.4 溶出度測定 取上述6 個廠家各1 批次樣品，分別按“2.2.1”方法操作，結果6 批次樣品在45 min時的溶出量均大于75%，見表3。

表3 樣品在45 min 時的溶出量（%）

3.討論

檢測波長的選擇。葡萄糖酸根有羰基氧和羥基氧上孤對電子的共軛作用所產生的末端吸收（205～215 nm），波長210 nm 處溶劑及輔料對葡萄糖酸鈣的測定不產生干擾，故選擇210 nm 為檢測波長。

流動相的選擇。葡萄糖酸為有機酸，極性較大，在反相柱上保留較弱，為增加葡萄糖酸鈣的保留，故采用水性柱和純水相作為流動相，由于磷酸鹽在紫外區幾乎無吸收，故選擇緩沖液；緩沖液的pH 對葡萄糖酸鈣的峰形影響較大，pH 較大時，葡萄糖酸發生酸式解離，造成峰拖尾，pH 減小由于抑制了葡萄糖酸的解離，峰形變銳，有利于準確定量；本實驗采用了0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（pH = 2.8）作為流動相，結果顯示，葡萄糖酸峰峰形好，柱效高，保留時間合適。

提取方法的選擇。采用流動相作為提取溶劑有利于充分提取葡萄糖酸鈣，但是葡萄糖酸鈣溶液不穩定，30 min 后會發生降解。根據葡萄糖酸鈣在水中緩緩溶解的物理性質，可采用簡便、快速的超聲提取的方式，該方式同樣可以充分提取葡萄糖酸鈣，且葡萄糖酸鈣水溶液在24 h 內穩定。