青翹感冒顆粒微生物限度檢查方法的建立

宋增炫，陳 媛，米 玲，鄧映明（通信作者）

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所生測室 廣東 梅州 514071）

青翹感冒顆粒為梅州市中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，其標(biāo)準為廣東省藥監(jiān)局的《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊標(biāo)準》粵ZB20110012。青翹感冒顆粒由大青葉、連翹、馬鞭草等5 味中藥經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝制成，具有清熱與解毒和解表的功效，主要用于治療常見的風(fēng)熱感冒及上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽喉炎。醫(yī)院制劑為了確保患者臨床使用的安全性，必須為其制定微生物限度檢查方法（照《中國藥典》2020 年版）以控制其微生物限度[1]。常規(guī)微生物限度檢測目前尚無其微生物限度檢查方法的報道。中藥成分較復(fù)雜，不同藥味組方常常含有抑菌物質(zhì)，且有些制劑含有防腐劑，常規(guī)微生物檢驗法檢驗往往會顯示假陰性的結(jié)果，發(fā)生微生物污染漏檢的情況[2-7]。本實驗建立了青翹感冒顆粒適合的微生物限度方法，提高了醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準，為監(jiān)管機構(gòu)提供了參考。

1.儀器與材料

1.1 儀器

電子天平（AE ADAMHighlandHCB602H）、CL-40M 立式壓力蒸汽滅菌鍋（高山有限公司）、GHO-9080N-3 恒溫培養(yǎng)箱（中國上海一恒公司）、BPMJ-250F霉菌培養(yǎng)箱（中國上海一恒公司）、THERMO 1384 A2 生物安全柜（THERMO（上海）儀器有限公司）、BPC-150F 生化培養(yǎng)箱（中國上海一恒公司）。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨培養(yǎng)基TSA（批號：1097453）、TSB胰酪大豆胨培養(yǎng)基（批號：1107232）、SDA 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（批號：1097161）、SDB 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（批號：1085972）、麥康凱MCB（批號：1093641）、麥康凱MAC（批號1095291）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號1196031）、VRBGA（紫紅膽鹽葡萄糖）（批號1094631）、RV 沙門菌培養(yǎng)基（批號1106591）、XLD 瓊脂培養(yǎng)基（批號1090311）均購自環(huán)凱微生物廣東有限公司。經(jīng)過適用性檢查，符合藥典四部通則1101、1102、1103 規(guī)定。

1.3 試劑

稀釋液：pH 7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，批號1085991。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003-5a8〕，銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10104-2a5〕,大腸埃希菌〔CMCC（B）44102-3a〕，枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63501-2a22-3〕均購于中國食品藥品檢定研究院。白色念珠菌〔CMCC（F）98001-2a〕，購與廣東環(huán)凱微生物有限公司。

黑曲霉定量工作菌株 菌種編號：CMCC（F）98003批號：1450-2014，由杭州微球科技有限公司提供。

1.5 供試品

青翹感冒顆粒，由梅州市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號20220309、20220323、20220412。

2.方法與結(jié)果

2.1 試驗菌液的制備

取新鮮培養(yǎng)物（銅綠菌、金葡菌、枯草菌）接種至10 mL TSB（胰酪大豆胨）培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取此培養(yǎng)液1 mL 加pH7.0 無菌Nacl-蛋白緩沖液9 mL，采用10 倍遞增稀釋法制成1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液；取新鮮培養(yǎng)物（白念珠菌），接種至10 mL SDB 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，取此培養(yǎng)液1 mL 加pH7.0 無菌NaCl-蛋白緩沖液9 mL，采用10 倍遞增稀釋法制成每1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液；取黑曲霉定量工作菌株，用1.1 mL 復(fù)溶液溶解后，制成1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液。以上5 種試驗菌用于微生物計數(shù)。另取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌制成50 ～100 cfu/mL 的菌懸液，用于控制菌檢查。菌液制備后若在實驗室溫室下放置的，則應(yīng)在2 h 內(nèi)使用完成；若保存在2 ～8 ℃的冰箱，則可在24 h 內(nèi)使用[8-9]。

2.2 供試液的制備

取供試品1 0 g，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基至100 mL，制成1:10的供試液。取1:10的供試液，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基制成1:50、1:80 的供試液[10]。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 平皿傾注法 ①試驗組：取1:10的供試液9.9 mL，加入上述（金葡、銅綠、枯草、白念、黑曲霉）5 種試驗菌液各0.1 mL，混勻，使其每1 mL 供試液里的加菌量不大于100 cfu。取1 mL 注平皿，每株試驗菌每種培養(yǎng)基制備2 個平皿。②供試品對照組：取1:10的供試液9.9 mL，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基0.1 mL，混勻，取1 mL 注平皿，平行制備2 個平皿[11]。③菌液對照組：取TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基9.9 mL,同法加入上述（金葡、銅綠、枯草、白念、黑曲霉）5 種試驗菌液各0.1 mL，進行微生物回收試驗。以上各組平皿按照《中國藥典》2020年版四部要求注入15 ～20 mL 溫度不超過45 ℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（用于需氧菌培養(yǎng)）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（用于霉菌和酵母菌培養(yǎng)），混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。測定各平皿菌落數(shù)，計算各試驗菌回收率，結(jié)果見表1 和表2。提示需氧菌總數(shù)計數(shù)采用平皿傾注法（1:10）實驗，金葡菌和枯草桿菌的回收率結(jié)果低于50%，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)試驗菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)。表明青翹感冒顆粒對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌活性[12]，采用平皿傾注法（1:10）不能消除其抑菌活性，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)可采用平皿傾注法（1:10）。

表1 平皿傾注法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

表2 平皿傾注法霉菌和酵母菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.2 稀釋法 ①試驗組：取1:50、1:80 的供試液各9.9 mL，加入金葡球菌懸液（2.1）和枯草菌懸液（2.1）各0.1 mL,混勻，分別取1 mL 注皿，每株試驗菌平行制備2 個平皿。并注入15 ～20 mL TSA（胰酪大豆胨瓊脂）培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)24 h。測定各平皿菌落數(shù)，并計算金葡菌及枯草菌的回收率。②供試品對照組：取1:50、1:80 的供試液各9.9 mL，不加菌，以胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替試驗菌液，同試驗組操作。③菌液對照組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9 mL，加入試驗組的2 種試驗菌液各0.1 mL，其余操作同試驗組。試驗結(jié)果見表3。提示可知需氧菌總數(shù)計數(shù)采用稀釋法，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率低于50%，表明采用稀釋法不能去除其抑菌活性。

表3 稀釋法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.3 薄膜過濾法 ①試驗組：取“2.2”項下1:10供試液1 mL 兩組，分別加入置有100 mL 的pH7.0 無菌NaCl-蛋白緩沖液中，混勻，過濾。用pH7.0 無菌NaCl-蛋白緩沖液200 mL 進行濾膜沖洗兩次，即100 mL/次，在第2 次1 0 0 mL 的沖洗液中分別加入≤100 cfu 的金葡球菌及枯草桿菌菌液，抽濾結(jié)束后，迅速將濾膜的菌面朝上放置于TSA 胰酪大豆胨培養(yǎng)基平板上。②供試品對照組：以稀釋液代替試驗菌液，其余同試驗組制備。③菌液對照組：以稀釋液代替供試液，其余同法按試驗組制備。將上述試驗組等各組平皿按照《中國藥典》2020年版四部要求在規(guī)定條件下培養(yǎng)[13]。測定各組菌落，計算、即得各組回收率，結(jié)果金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌回收率均符合通則規(guī)定（50%～200%）的范圍內(nèi)，表明采用薄膜過濾法可去除青翹感冒顆粒的抑菌活性。取1:10 供試液和用于微生物計數(shù)的5 種試驗菌液，按以上薄膜過濾法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗，見表4。

表4 薄膜過濾法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.4 試驗結(jié)果 由表4、表2 可知青翹感冒顆粒采用薄膜過濾法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗，采用平皿傾注法（1:10）進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗，各試驗菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定，表明該方法有效、可行。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗（常規(guī)法）

（1）大腸埃希菌。取1:10 的供試液10 mL 和1.0 mL菌懸液（大腸埃希菌）（菌落數(shù)為50 ～100 cfu），加入到100 mL TSB（胰酪大豆胨培養(yǎng)基）中，混勻，于35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,即為試驗組。取1:10 的供試液10 mL，以稀釋液代替試驗菌液，其余操作同試驗組，作為供試品對照組。取TSB 代替供試液，其他同供試品對照組，作為陰性對照組。分別取上述TSB 培養(yǎng)物1.0 mL接種至100 mL MCB 麥康凱液體培養(yǎng)基中，置44 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取上述MCB 培養(yǎng)物劃線接種于MAC（麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板）上，于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。（2）耐膽鹽革蘭陰性。取1:10 的供試液，25 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h。分別取1 mL 的預(yù)培養(yǎng)物各2 份，1 份加入銅綠假單胞桿菌懸液（不大于100 cfu），1 份加入大腸埃希菌懸液（不大于100 cfu），接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)48 h，作為試驗組。取1 mL 預(yù)上述腸道菌增菌液接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為供試品對照組。取TSB 代替供試液，其他同供試品對照組，作為陰性對照組[14]。取上述EE 培養(yǎng)物接種劃線在VRBGA（紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板上，于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。（3）沙門菌。①試驗組：取供試品10.0 g，加入沙門1.0 mL 菌懸液（≤100 cfu），直接接種至100 mL TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基中，混勻、培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物0.1 mL 接種至10 mLRV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24 h。取少量培養(yǎng)物（RV 沙門菌增菌液中）劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）平板上，35 ℃培養(yǎng)48 h。②供試品對照組：取供試品10 g，直接接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同試驗組。③陰性對照組：以TSB 代替供試液，其他同供試品對照組，作為陰性對照組。（4）試驗結(jié)果。以上各組控制菌檢查試驗結(jié)果見表5。提示采用常規(guī)法進行控制菌檢查方法適用性試驗，試驗組均能檢出試驗菌，陰性對照組均無菌落生長，表明該試驗方法可行。

表5 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

表6 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

3.討論

微生物是具繁殖力的活細胞，其在藥品中會受到種種因素的影響處于不穩(wěn)狀態(tài)，導(dǎo)致檢驗結(jié)果的不準確，如藥品儲存條件、供試品的組合、原料來源、生產(chǎn)工藝的差別、檢驗方法的不同等都可造成結(jié)果的差異，影響因素中供試品的組合尤為重要。有些本身含有抑菌成分，如中藥黃芩、冰片、青黛中都含有較強的殺菌成分，而在一定濃度下，對微生物僅起到抑菌作用，如抑菌成分消除或濃度降低，仍可生長、繁殖。采用常規(guī)法檢驗往往會顯示假陰性的結(jié)果，還有些藥品為保證質(zhì)量，需在低溫甚至冷凍環(huán)境中保存，可使細菌存活狀態(tài)發(fā)生改變，呈休眠狀態(tài)。因此微生物檢驗時應(yīng)根據(jù)以上所述的種種情況采用不同的檢驗方法，使微生物處于穩(wěn)定狀態(tài)后，檢驗結(jié)果才能反映藥品的真實污染狀況[15]。

由于藥品的抑菌活性會影響到微生物限度檢查的準確性，為了消除其抑菌活性，本試驗從常規(guī)法入手[16]。由微生物計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果可知青翹感冒顆粒中的成分對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌活性，采用常規(guī)的平皿傾注法不能進行需氧菌總數(shù)計數(shù)。本試驗選擇稀釋法，制備1:50、1:80 的供試液對需氧菌總數(shù)計數(shù)進行方法適用性試驗，結(jié)果表明，采用稀釋法不能消除其抑菌活性。進一步選擇薄膜過濾法，結(jié)果提示，各試驗菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國藥典》2020 年版有關(guān)規(guī)定，確定需氧菌總數(shù)計數(shù)采用薄膜過濾法；霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)采用平皿傾注法（1:10）；青翹感冒顆粒對控制菌無抑菌活性，可采用常規(guī)法進行控制菌檢查。