串聯(lián)固相萃取柱凈化法提取辣椒醬中的蘇丹紅

宋曉婉，鐘亞安，宋旭鳳，代真真，梁先龍

(安徽中青檢驗(yàn)檢測有限公司，安徽合肥 230088)

蘇丹紅染料是一種人工合成的以苯基偶氮萘酚為主要基團(tuán)的親脂性偶氮化合物，蘇丹紅 I 化學(xué)名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚，蘇丹紅 Ⅱ 化學(xué)名稱為 1-[(2，4-二甲基苯)偶氮]-2-萘酚，蘇丹紅 Ⅲ 化學(xué)名稱為 1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮-2-萘酚，蘇丹紅 IV 化學(xué)名稱為1-2-甲基-4-[(2-甲基苯)偶氮]苯基偶氮-2-萘酚，因蘇丹紅類物質(zhì)含有氮氮雙鍵(偶氮基)，即結(jié)構(gòu)式中的—N==N—，與連接在其兩端的苯環(huán)一起構(gòu)成發(fā)色基團(tuán)，偶氮基與芳香結(jié)構(gòu)構(gòu)成的偶氮苯大共軛體系能夠吸收一定波長的可見光，故含有偶氮苯體系的物質(zhì)能顯現(xiàn)出一定的顏色使其外觀為暗紅色或深黃色片狀體，主要用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。經(jīng)研究表明，蘇丹紅具有致突變和致癌性[1-2]，我國和歐盟都禁止用于食品中，但仍有一些不法分子在利益驅(qū)使下，在飼料中加入蘇丹紅染料，家禽食入體內(nèi)后得到好看的“紅黃蛋”。

目前，食品中蘇丹紅的檢測方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法[3-6]、液相色譜質(zhì)譜法[7-11]、液相色譜法[12-13]、薄層色譜法[14-15]等，而國內(nèi)已熟知蘇丹紅的檢測方法為 GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》[16]，國標(biāo)法中用氧化鋁小柱凈化樣品，采用液相色譜法檢測食品中的蘇丹紅，該方法操作煩瑣、結(jié)果重現(xiàn)性差，且針對基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì)。張鑫等[17]解決了國標(biāo)中的中性氧化鋁固相萃取柱手工填裝且不容易把握填裝量的困難，通過對不同填料量的市售中性氧化鋁固相萃取柱進(jìn)行比較，選擇了其中一款500 mg/6 mL 的中性氧化鋁固相萃取柱，但是對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，凈化效果不好，基質(zhì)干擾較多，回收率較低，且依然存在氧化鋁活度難以掌控的問題。程曉宏等[12]利用分子印跡固相萃取小柱能選擇性地識別和富集蘇丹紅染料，正己烷淋洗樣品中油性雜質(zhì)，二氯甲烷洗脫蘇丹紅染料的原理提取樣品中的蘇丹紅，但是對于油脂較多的辣椒醬來說，仍然存在富集液體顏色深、基質(zhì)干擾大的困擾。根據(jù)蘇丹紅具有親脂性的化學(xué)性質(zhì)，筆者嘗試采用以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)為串聯(lián)固相萃取柱填料代替氧化鋁作為固相萃取材料來凈化樣品，選擇合適的淋洗液和洗脫液，同時(shí)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件，達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確地測定樣品中蘇丹紅含量 。

1 材料與方法

1.1 儀器液相色譜儀，美國 Thermo fisher公司；JK-500型超聲波清洗器，TGL-16M 離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；G560E 渦旋混勻器，上海佳能電子科技有限公司；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司。HSC-24B氮?dú)獯蹈蓛x，天津恒奧科技發(fā)展有限公司；蘇丹紅專用柱、PSD固相萃取柱、HLB固相萃取柱，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品來源為 Dr.Ehrenstorfer.，以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均為99.0%；乙醚、乙腈、甲酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純，德國Merck公司；一級水，由超純水系統(tǒng)制備。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制準(zhǔn)確稱取蘇丹紅Ⅰ ～ Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醚溶解后，用色譜級丙酮配制成 0.1 mg/mL 的儲備液，臨用時(shí)再用丙酮稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃下避光保存。

1.4 液相色譜條件色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)；流動相為乙腈(A)∶水(B)(90∶10，v/v)，等度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長分別為蘇丹紅Ⅰ 478 nm、蘇丹紅Ⅱ 520 nm、蘇丹紅Ⅲ 520 nm、蘇丹紅Ⅳ 520 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 樣品前處理準(zhǔn)確稱取 2.000 g(精確至 0.001 g)試樣于離心管中，加入 10 mL 正己烷，渦旋混勻 1 min，超聲提取 5 min，以5 000 r /min 的速度離心 3 min，移出上清液，下層固體再用 5 mL 正己烷提取 2次，合并提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL左右后加入用正己烷活化過的PSD柱和HLB柱的串聯(lián)柱中，以 3 mL 正己烷淋洗2次，棄去淋洗液，去掉上面的PSD柱，并抽干下面的HLB柱，最后用 5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀 于45 ℃下氮吹至近干。用 1 mL 乙腈溶解定容，渦旋 10 s 后過 0.22 μm 有機(jī)濾膜，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法國標(biāo)方法中采用正己烷-丙酮提取，中性氧化鋁為吸附劑進(jìn)行凈化，過程煩瑣，試劑消耗量大，且對中性氧化鋁活度難以控制。目前市面上出現(xiàn)多種蘇丹紅專用小柱，在進(jìn)行多家比對試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)在處理辣椒醬、辣椒油等基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時(shí)，仍然出現(xiàn)洗脫液顏色較深、雜峰較多、基質(zhì)效應(yīng)依然存在等問題。該試驗(yàn)中對于高含量油脂的辣椒醬首先采用正己烷進(jìn)行提取，渦旋超聲增加提取效率，然后將提取液加入去油脂和蘇丹紅富集的串聯(lián)柱中，樣品通過去除油脂后被富集至下層小柱，再用洗脫液進(jìn)行收集。

2.2 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液的優(yōu)化國標(biāo)方法中用0.1%甲酸水、乙腈、丙酮作為流動相，4 種蘇丹紅在色譜柱中均可以達(dá)到分離效果，但是比較煩瑣，該試驗(yàn)采取乙腈和水作為流動相，在試驗(yàn)中嘗試調(diào)整流動相乙腈和水的比例為100∶0、95∶5和90∶10時(shí)，發(fā)現(xiàn)4種蘇丹紅在90∶10時(shí)均能達(dá)到很好的分離效果。因?yàn)橐合嗌V方法是反向色譜法，流動相中含有水，在用國標(biāo)方法正己烷作為標(biāo)準(zhǔn)溶液定容液體時(shí)，正己烷與水不互溶導(dǎo)致色譜峰形不理想，該試驗(yàn)嘗試采用丙酮定容，峰形改善效果明顯。

2.3 洗脫液的選擇購買基質(zhì)比較復(fù)雜的辣椒醬陽性樣品，采用串聯(lián)柱凈化的方法，研究丙酮-正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯3種不同洗脫溶劑對4種蘇丹紅的洗脫能力。由圖1可見，不同洗脫溶劑對蘇丹紅Ⅲ的效果無明顯變化，但蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ通過丙酮-正己烷的洗脫效果均為最差，而乙酸乙酯對4 種蘇丹紅的洗脫效果均是最好的，且乙酸乙酯的毒性相對較小。

圖1 不同溶劑洗脫效率的比較Fig.1 Comparison of elution efficiency of different solvents

2.4 凈化方式的選擇因?yàn)檎和榈臉O性很低，對油脂類物質(zhì)也有很好的溶解性，在使用正己烷作為提取劑提取樣品中蘇丹紅時(shí)，不可避免地也會把樣品中的一些油脂成分提取出來，因此在凈化過程中提前除去樣品中的油脂成分就顯得非常必要?，F(xiàn)行國標(biāo)GB/T 19681—2005中規(guī)定的方法是使用中性氧化鋁柱來凈化樣品中的油脂，該方法的缺點(diǎn)是操作比較煩瑣，針對基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì)，且中性氧化鋁柱的活度難以控制導(dǎo)致4種蘇丹紅染料的保留差異較大，回收率不穩(wěn)定。因此該試驗(yàn)針對上述問題進(jìn)行了研究，將蘇丹紅專用柱和PSD串聯(lián)HLB柱的效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，蘇丹紅專用柱不能有效去除油脂帶來的干擾，大部分油脂依然會伴隨蘇丹紅一起洗脫下來，如圖2a所示基質(zhì)干擾峰較多，基質(zhì)干擾強(qiáng)度較大，且與目標(biāo)化合物保留時(shí)間接近，因此不能準(zhǔn)確定量。而使用PSD串聯(lián)HLB柱的基質(zhì)干擾現(xiàn)象(圖2b)明顯低于使用蘇丹紅專用柱。這是因?yàn)镻SD柱和HLB柱填料均可以有效地去除樣品中的油脂成分，并且正己烷淋洗液可以將目標(biāo)化合物富集至HLB柱中，再用乙酸乙酯對HLB柱進(jìn)行洗脫，即可有效達(dá)到凈化效果，此過程操作更為簡單、溶劑消耗量更少、回收率較穩(wěn)定且能達(dá)到國標(biāo)要求。

注：1.蘇丹紅Ⅰ；2.蘇丹紅Ⅱ；3.蘇丹紅Ⅲ；4.蘇丹紅ⅣNote：1.Sudan dye I；2.Sudan dye Ⅱ；3.Sudan dye Ⅲ；4.Sudan dye Ⅳ圖2 蘇丹紅專用柱(a)和串聯(lián)柱(b)凈化效果色譜圖Fig.2 Chromatogram of purification effect of Sudan dye special column(a)and tandem column(b)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限以丙酮為溶劑，配制蘇丹紅Ⅰ～ Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，進(jìn)樣10 μL，HPLC分析測定，以峰面積(Y)對濃度 (X，μg /mL)進(jìn)行回歸分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 回歸方程分別為Y=0.502 8X-0.007 9(蘇丹紅Ⅰ)、Y= 0.582 5X-0.012 1(蘇丹紅Ⅱ)、Y=0.781 6X-0.008 2(蘇丹紅Ⅲ)、Y=0.824 7X-0.017 4(蘇丹紅Ⅳ)，決定系數(shù)(R2)均大于 0.999，表明蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在0.01～0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該方法適用于辣椒醬中蘇丹紅染料的定量分析。 取陰性辣椒醬樣品，加入逐級稀釋不同濃度的蘇丹紅Ⅰ～ Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行樣品處理并上機(jī)，測得信噪比為 3時(shí)對應(yīng)的蘇丹紅的檢出限均為5.0 μg/kg。

2.6 回收率與精密度該試驗(yàn)選用市場上3種含油量和含水量不同的3種陰性辣椒醬樣品，采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，添加濃度分別為15.0、30.0 和 75.0 μg/kg，對 4種蘇丹紅染料進(jìn)行了添加回收率試驗(yàn)，取6次操作的平均值。從表1可以看出，4種蘇丹紅在 3 種不同加標(biāo)濃度下的回收率為 84%～95%，RSD為1.5%～6.1%。

表1 辣椒醬中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的加標(biāo)回收率及RSD(n=6)

3 結(jié)論

該研究討論了對于基質(zhì)復(fù)雜的辣椒醬，采用正己烷提取，以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)的串聯(lián)固相萃取柱填料進(jìn)行有效凈化，并結(jié)合高效液相色譜儀測定其中4種蘇丹紅染料的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加濃度分別為15.0、30.0、75.0 μg/kg 時(shí)，4種蘇丹紅回收率在84%～95%，RSD在1.5%～6.1%；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在0.01～0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.999)，檢出限為5.0 μg/kg。該方法操作簡便、準(zhǔn)確度和靈敏度較國標(biāo)高，適用于辣椒醬中痕量蘇丹紅染料的殘留檢測。