油樟愈傷組織誘導(dǎo)及細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

何秀燕，魏 琴,2，趙 鑫

（1.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川宜賓 644000；2.四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川宜賓 644000）

油樟（Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H.W.Li）是樟科樟屬常綠喬木，為亞熱帶地區(qū)特有樹種[1]，具有很高的經(jīng)濟價值和生態(tài)意義.油樟在宜賓栽培面積大，宜賓素有“油樟王國”的美譽[2-4].油樟葉片利用水蒸氣蒸餾法可得油樟精油，種子經(jīng)壓榨亦可得精油（可用作工廠制香皂、潤滑油等）.油樟精油富含多種植物次生代謝物，化學(xué)成分大約100余種.油樟精油1,8-桉葉素成分可達50%～60%，該成分具有抗菌消炎[5]、疏風(fēng)解熱、祛濕解毒、殺蟲的作用[6,7]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和化工方面.

植物不同部位影響外植體愈傷組織的產(chǎn)生[8].樟科樟屬植物龍腦樟組織培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)研究較多.龍腦樟嫩枝通過適宜的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)出愈傷組織，且能夠提取出右旋龍腦[9].通過對龍腦樟腋芽誘導(dǎo)，獲得無菌苗及愈傷組織[10].不同的培養(yǎng)基激素濃度與配比，影響龍腦樟莖段誘導(dǎo)出芽或愈傷組織[11].通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)對植物原生質(zhì)體進行細胞懸浮培養(yǎng)[12]，細胞懸浮可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，應(yīng)用于生物制品的研發(fā)與開發(fā)等[13].植物細胞懸浮培養(yǎng)是將固體培養(yǎng)基上質(zhì)地疏松、生長旺盛的植物愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，以獲取大量均一的植物細胞培養(yǎng)物[14].培養(yǎng)材料、培養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件和方式等因素影響林木懸浮體系的建立[15].目前，油樟組織培養(yǎng)研究主要集中在培養(yǎng)基成分、激素種類及濃度等方面.培養(yǎng)基中蔗糖濃度、瓊脂含量、細胞分裂素含量等因素對油樟試管苗玻璃化有明顯影響[16].培養(yǎng)基中無機鹽濃度、抗生素含量及光照處理對油樟愈傷組織生長具有明顯影響[17].為進一步提升油樟組培擴繁水平，消毒劑、基本培養(yǎng)基、激素等因素被廣泛研究[18].不同培養(yǎng)基及不同激素種類對油樟懸浮細胞的生長及其次生代謝產(chǎn)物有著顯著的影響[19].樟屬植物葉水浸提液對油樟懸浮細胞生長無明顯影響，但對懸浮細胞揮發(fā)性物質(zhì)積累有一定的影響[20].影響植物愈傷組織及懸浮細胞生長的因素很多，基本培養(yǎng)基、外植體類型、激素濃度、光照、pH值和碳含量如何影響油樟愈傷組織產(chǎn)生及細胞懸浮培養(yǎng)目前尚無明確研究.因此，本研究以油樟一年生幼嫩枝條莖段、葉片為材料，結(jié)合不同培養(yǎng)基、不同6-BA濃度篩選出適宜愈傷組織誘導(dǎo)的外植體和基本培養(yǎng)基；進一步分析NAA濃度、蔗糖含量、pH值、光照等環(huán)境條件對油樟懸浮細胞生長及其代謝產(chǎn)物的影響，篩選出適宜的油樟愈傷組織誘導(dǎo)體系，同時建立油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系，可為進一步研究油樟細胞懸浮培養(yǎng)、進一步工業(yè)化提取油樟次生代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)與研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

分別選取當(dāng)年生油樟功能葉片、一年生幼嫩莖段（圖1）為外植體進行誘導(dǎo)愈傷組織.

圖1 油樟外植體

1.2實驗方法

（1）誘導(dǎo)油樟愈傷組織最佳外植體、培養(yǎng)基及激素濃度的篩選.將外植體分別接種到B5（NAA 0.01mg/L，6-BA 2mg/L）和MS（NAA 0.01mg/L，6-BA 2mg/L）固體培養(yǎng)基中，每個處理30瓶，重復(fù)3次.培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照（1000～2000）Lx，光照時間16 h/d，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計外植體愈傷組織誘導(dǎo)率及污染率，篩選出適宜誘導(dǎo)愈傷組織的外植體材料及適宜外植體生長的初代培養(yǎng)基：

將篩選出的最適外植體接種于初代培養(yǎng)基，設(shè)置三個6-BA激素濃度梯度：0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L.每組接種30瓶，重復(fù)3次.培養(yǎng)30 d后記錄愈傷組織生長情況，統(tǒng)計其誘導(dǎo)率，篩選出誘導(dǎo)愈傷組織最佳的激素濃度.

（2）油樟懸浮細胞培養(yǎng)最佳NAA濃度篩選.將油樟愈傷組織轉(zhuǎn)接于B5+6-BA（4.0mg/L）液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25±2℃，pH值5.8）.設(shè) 置3個NAA濃 度 梯 度：0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L.每組設(shè)置6個重復(fù)，每5 d觀察一次，記錄細胞懸浮生長狀態(tài).

（3）油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化.以B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）為基本培養(yǎng)基，分別改變油樟懸浮細胞培養(yǎng)基中糖含量、pH值、光照.蔗糖含量設(shè)置三個處理：0 g/L、20 g/L、40 g/L；pH值設(shè)置3個處理：6.0、6.8、7.2；光照設(shè)置兩個處理：光照（2000 Lx）、黑暗(0 Lx).每個處理6個重復(fù)，培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25±2℃.每5 d觀察一次，記錄其生長狀態(tài)，并用紫外分光光度計測定每次的總酚、類黃酮和總抗氧化的吸光值，以及用電子天平測定其干重和鮮重.

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和顯著性分析（p＜0.05）.

2 結(jié)果與分析

2.1 油樟愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)

2.1.1 誘導(dǎo)油樟愈傷組織最佳外植體、培養(yǎng)基及6-BA濃度

將油樟葉片及枝條分別接種于B5、MS培養(yǎng)基，分析培養(yǎng)基對油樟不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的影響.相同培養(yǎng)基條件下，油樟莖段愈傷組織出愈率顯著高于葉片，葉片玻璃化嚴(yán)重（圖2），因此幼嫩莖段適宜誘導(dǎo)愈傷組織.B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，顏色呈淡黃色，更適宜細胞懸浮培養(yǎng).MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地致密，顏色呈淺綠色，不利于細胞懸浮培養(yǎng)（圖2）.B5培養(yǎng)基外植體污染率顯著低于MS（表1）.因此，將油樟幼嫩枝條接種于B5培養(yǎng)基有利于愈傷組織誘導(dǎo)，且污染率低.

圖2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)油樟愈傷組織

表1 不同培養(yǎng)基和外植體出愈率及污染率

以油樟一年生幼嫩枝條為外植體，B5為基本培養(yǎng)基，分別設(shè)置6-BA三個濃度梯度，分析6-BA濃度對油樟愈傷組織形成的影響，發(fā)現(xiàn)4.0 mg/L處理下外植體易形成愈傷組織，結(jié)構(gòu)疏松適于懸浮培養(yǎng)，顏色呈淡黃色（圖3C），且污染率顯著低于其他處理（表2）.在0 mg/L處理外植體正常生長，切口處褐化，但愈傷組織誘導(dǎo)率低（圖3A），出愈率僅為6.7%，且污染率高達66.7%（表2）.2.0 mg/L 6-BA處理外植體雖能產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、質(zhì)地堅硬，不易進行懸浮培養(yǎng)（圖3B）.

圖3 不同濃度的6-BA誘導(dǎo)油樟愈傷組織的影響

表2 不同濃度6-BA對出愈率及污染率的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on recovery rate and pollution rate

2.1.2 油樟懸浮培養(yǎng)最佳NAA濃度的篩選

將繼代培養(yǎng)的油樟愈傷組織轉(zhuǎn)接于不同濃度NAA的B5液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分析NAA濃度對油樟細胞懸浮培養(yǎng)的影響.實驗表明，0 mg/L NAA濃度下無明顯細胞增殖（圖4A），0.5 mg/L NAA濃度下懸浮細胞生物積累量大，但易褐化（圖4B）.1.0 mg/L NAA濃度下懸浮細胞增殖較快，生物積累量大，生長狀態(tài)較好且細胞分散程度較均勻（圖4C）.通過觀察懸浮培養(yǎng)液，油樟懸浮細胞呈橢圓形或球形，F(xiàn)DA染色后懸浮細胞表現(xiàn)出熒光強度高且熒光分布均勻，細胞活性強（圖5）.因此1.0 mg/L NAA的生長素濃度更適合油樟細胞的懸浮培養(yǎng).

圖4 不同的NAA對油樟懸浮培養(yǎng)的影響

圖5 油樟懸浮細胞

2.2 油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化

2.2.1 蔗糖含量對油樟懸浮細胞的影響

為了進一步優(yōu)化油樟懸浮培養(yǎng)體系，在B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）培養(yǎng)基中設(shè)置不同蔗糖濃度，分析不同蔗糖對油樟懸浮細胞生長的影響.發(fā)現(xiàn)在蔗糖濃度為40 g/L處理下油樟懸浮細胞鮮重高于低濃度處理，干重在第15天時顯著高于其他處理（圖6A、B）.隨著蔗糖濃度增大，其總酚含量、類黃酮含量及抗氧化能力越高，蔗糖濃度為40 g/L時，其總酚、類黃酮含量及總抗氧化能力顯著高于其他處理（圖6C、D、E）.

圖6 培養(yǎng)基碳含量對油樟懸浮細胞的影響

2.2.2 pH值對油樟懸浮細胞的影響

在B5+6-BA（4.0mg/L）+NAA（1.0mg/L）培養(yǎng)基中設(shè)置不同pH，分析pH對油樟懸浮細胞生長的影響.在pH值為6.0，培養(yǎng)10 d時，細胞鮮重達到峰值后逐漸下降且WPA（鮮重0.2443 g）＞W(wǎng)PB（鮮重0.2104 g）＞W(wǎng)PC（鮮重0.1344 g）（圖7A）.而在pH6.0處理下第15 d時干重達到最大值，高于其他處理（圖7B）.隨著培養(yǎng)基pH的增加，懸浮細胞總酚、類黃酮及總抗氧化活性反而降低，pH為6.0時總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于其他處理（圖7C、D、E）.

圖7 pH對油樟懸浮細胞的影響

2.2.3光照對油樟懸浮細胞的影響

以B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）為培養(yǎng)基，分別設(shè)置光照和黑暗兩種培養(yǎng)條件，分析光照對油樟懸浮細胞的影響.實驗表明，油樟懸浮細胞干鮮重受光照影響明顯，暗培養(yǎng)細胞鮮重高于光照培養(yǎng)（圖8A）.除第5、15天，暗培養(yǎng)下細胞干重顯著高于光培養(yǎng)（圖8B）.暗培養(yǎng)總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于光培養(yǎng)（圖8C、D、E），懸浮細胞類黃酮含量在暗培養(yǎng)下比光培養(yǎng)高0.1556μg/ml（圖8D）.

圖8 光照對油樟懸浮細胞的影響

3 討論及結(jié)論

植物懸浮細胞培養(yǎng)所需要的愈傷組織應(yīng)生長旺盛且質(zhì)地疏松，同時具有較高的次生代謝產(chǎn)物.植物不同組織、培養(yǎng)基、激素等因素影響植物愈傷組織的生長.油樟組培中，兩年生莖段比當(dāng)年生莖段易玻璃化，污染率高[16].植物不同組織、不同器官愈傷組織誘導(dǎo)率不同，桂花花梗愈傷組織誘導(dǎo)率比花瓣高[21]，葡萄帶芽莖段相比葉片和卷須更易誘導(dǎo)出愈傷組織[22].本研究中以油樟一年生莖段與葉片為外植體，相同條件培養(yǎng)后莖段愈傷組織誘導(dǎo)率高于葉片，葉片在誘導(dǎo)過程中玻璃化嚴(yán)重.激素對植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響比誘導(dǎo)愈傷組織更大，外源激素的合理濃度是誘導(dǎo)懸浮細胞增殖的關(guān)鍵[23].生長素NAA濃度高時，誘導(dǎo)出淡黃色且疏松的愈傷組織[24].本研究中較高濃度的NAA（1.0 mg/L）懸浮細胞增殖較快，生物積累量大，細胞活性強.

不同的培養(yǎng)條件，影響植物懸浮細胞培養(yǎng).培養(yǎng)條件主要包括基本培養(yǎng)基種類、激素種類及濃度、培養(yǎng)基pH值和附加物等.蔗糖作為一種碳源，一般認為較高濃度的蔗糖促進次生代謝物合成，可為呼吸作用提供底物，為細胞新陳代謝提供能量，可以調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓[25]，為代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生提供前體[26]，是植物離體培養(yǎng)不可或缺的一類營養(yǎng)物質(zhì).因此，油樟懸浮細胞合成次生代謝產(chǎn)物需要蔗糖提供能量，由實驗結(jié)果可知隨著蔗糖濃度增大，其總酚含量、類黃酮含量及抗氧化能力越高，表明培養(yǎng)基中高濃度的蔗糖含量可有效提升次生代謝產(chǎn)物含量.植物懸浮細胞生長受培養(yǎng)基pH的影響.pH除調(diào)節(jié)細胞膜透性，還會影響植物細胞的離子通道活性、細胞器完整性等方面[27].pH會對橡膠樹懸浮細胞[28]、馬鈴薯愈傷組織[29]有明顯影響.培養(yǎng)基的pH值對次生代謝物的分泌很重要，植物的細胞培養(yǎng)都要求一定的pH值，研究發(fā)現(xiàn)pH值為5.8～6.5范圍內(nèi)懸浮培養(yǎng)煙草細胞能獲得最多的生物量和次生代謝產(chǎn)物量[30].由實驗可知油樟細胞懸浮培養(yǎng)的最適pH為6.0，該pH下次生代謝產(chǎn)物量和生物積累量較高.

環(huán)境因素，如光照、溫度、濕度和氣體成分等也能夠影響植物懸浮細胞培養(yǎng).光是植物必需的資源之一，光照對植物生長的直接作用是光能促進細胞的增大和分裂，促進組織和器官的分化，制約器官的生長和發(fā)育速度[31].本研究以光照與黑暗對油樟懸浮細胞進行處理，黑暗處理油樟懸浮細胞總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于光培養(yǎng)，進一步證明了黑暗培養(yǎng)有利于油樟懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物的生成[19].蛇足石杉共生藍藻細胞只能在較低的光照強度下生存[32].但部分植物，如西洋參細胞有無光照對培養(yǎng)西洋參細胞無差別[33].