一株耐鹽產香魯氏接合酵母FA-1的鑒定及其在醬油釀造中的應用

續丹丹，王文平，張 欣，高 航，張 建，楊春暉，鞠 巖

（北京食品科學研究院，北京 100068）

醬油起源于中國，傳統釀造醬油有著兩千多年的悠久發展歷史，是我國勞動人民的智慧結晶[1]。醬油是由大豆或脫脂大豆等蛋白質原料、面粉或麩皮等淀粉原料與食鹽、水等經眾多微生物的長期發酵作用釀制而成[2]。這些微生物能夠產生蛋白酶、淀粉酶等不同的酶類，催化發酵過程中原料的降解與特征化合物的形成，賦予醬油獨特的風味和營養[3]。其中，以醬油制曲階段的米曲霉和醬醪發酵階段的耐鹽性乳酸菌和耐鹽性酵母菌為釀造過程中的關鍵微生物[4-6]。

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種具有較強耐鹽性的增香酵母，在醬油發酵過程中可以代謝產生多種醇類、酸類和酯類化合物，是醬油釀造過程中的核心微生物[2-3]。研究表明，魯氏接合酵母可以提升乙醇、苯乙醇、2-甲基-1-丙醇等醇類物質以及4-乙基愈創木酚和多種醛酮類化合物的含量[7-9]。MENG Q等[10]研究發現，接種魯氏接合酵母強化發酵日式醬油，醬油中某些特殊香味物質的含量要高于接種易變假絲酵母（Candida versatilis）。張倩等[11]從郫縣豆瓣中分離篩選一株魯氏接合酵母HJ-7Y.1，該菌株在高鹽濃度下仍具有較好的產醇性能，且能代謝產生苯乙醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醇和乙酸苯乙酯等多種香氣成分。彭東等[12]從高鹽稀態醬醪中分離篩選出一株耐鹽生香酵母CS2.42，經鑒定為魯氏接合酵母，添加該酵母發酵的醬油中酯類、醇類、醛類及酚類等揮發性風味物質含量均有提升。除了增香方面的研究，前期研究還較多集中在魯氏接合酵母的基因和耐鹽機制等[13-14]，借助其耐鹽特性，將一些關鍵的水解酶，例如蛋白酶、肽酶和谷氨酰胺酶等在魯氏接合酵母上表達，以期在醬油發酵過程中產生充分的水解作用，提高醬油品質[15]。

本研究擬對醬油醪液中篩選的具有耐鹽產香性能的酵母菌株進行形態觀察、生理生化和分子生物學鑒定，分析其生長特性及耐受性，并將其應用于醬油釀造。采用頂空固相微萃取-氣質聯用（headspace solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術分別檢測其在不同NaCl濃度的醬油發酵液及醬油成品中的揮發性香氣成分，探究菌株的產香性能，以期豐富功能酵母的菌種資源，提高醬油風味及品質，對醬油產業發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株FA-1：北京市食品釀造研究所有限責任公司，自高鹽稀態醬油醪液中分離篩選、保藏。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水補至1 000 mL。121 ℃滅菌15 min。

醬油發酵培養基（NaCl終含量為11%）：生醬油（NaCl含量為18%）100 mL，NaCl 92 g，MgS O4·7H2O 0.5 g，酵母粉1g，CaCl20.075g，葡萄糖50g，KH2PO41g，加水補至1 000mL。121 ℃滅菌15 min。

醬油高鹽培養基：在醬油發酵培養基的基礎上調整NaCl含量分別為12%、15%、18%、20%、22%。

無碳源基礎培養基：（NH4）2SO42 g，NaCl 1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水補至1 000 mL。121 ℃滅菌15 min。

麥芽汁培養基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g。121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

DNeasy Plant Mini Kit試劑盒：德國QIAGEN公司；引物NL1和NL2：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）MasterMix（含染料）、RNase-free水：天根生化科技（北京）有限公司；DL 20009（plus 100）、DL 500脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：寶生物工程（大連）有限公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：英國Oxoid公司；瓊脂（生化試劑）：北京博奧拓達科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Ecotron振蕩培養箱：瑞士INFORS公司；LHS-250SC恒溫恒濕生物培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Eppendorf 5417R冷凍離心機：艾本德（中國）有限公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T100梯度PCR儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；UV-2802PC分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；頂空固相微萃取裝置DVB/CAR/PDMS萃取器：美國Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 產香酵母的分離篩選

取10 g醬油發酵醪液至三角瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，30 ℃、120 r/min振蕩洗脫30 min，將洗脫得到的原液梯度稀釋至10-1～10-6，吸取各梯度稀釋液100 μL均勻涂布于含10%NaCl的YEPD固體培養基上，每個梯度3個平行，30 ℃靜置培養48 h。挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進行反復劃線分純。純化后菌株分別接種于麥芽汁培養基，30 ℃、120 r/min振蕩培養48 h后進行嗅聞試驗[16]，得到一株產生濃郁醬香味的菌株，命名為FA-1。

1.3.2 菌株FA-1的鑒定

（1）菌株細胞顯微形態觀察

將活化后的菌株FA-1接種于醬油發酵固體培養基中，30 ℃恒溫培養24 h，觀察記錄培養基上菌落的形態、質地、厚薄程度等特征。用接種環挑取典型菌落進行鏡檢，觀察菌體形態。

（2）生理生化試驗

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[17]，測試菌株FA-1對碳源的發酵或同化能力。

（3）分子生物學鑒定

使用酵母基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株的基因組DNA并采用通用引物NL1和NL2 對26S rDNA的D1/D2區進行特異性擴增。PCR擴增體系（50 μL）：DNA模板2 μL、正反引物（10 μmol/L）2 μL、PremixSTAR HS（Takara）25 μL，無菌純水補齊到50 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，35個循環，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR反應產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統觀察結果并成像。PCR產物委托賽默飛世爾科技公司進行測序。將測序結果登錄美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網站用GenBank數據庫基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，選取同源性高的模式菌株序列，使用MEGA 5.0軟件鄰位連接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，進行1 000次的相似度重復計算，確定其系統發育學地位。

1.3.3 菌株FA-1耐受性及生長特性分析

（1）溫度耐受性

將活化后的菌株FA-1按1%的接種量接種于醬油發酵培養基中，然后分別置于28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃和42 ℃條件下120 r/min振蕩培養24 h，于600 nm波長處測定吸光度值（OD600nm值），考察菌株FA-1的溫度耐受性。

（2）pH值耐受性

將活化后的菌株FA-1按1%的接種量接種于pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的醬油發酵培養基中120 r/min、30 ℃振蕩培養24 h，于600 nm波長處測定吸光度值，考察菌株FA-1的pH值耐受性。

（3）耐鹽性

將活化后的菌株FA-1按1%的接種量接種于NaCl質量分數分別為12%、15%、18%、20%和22%的醬油高鹽培養基中30 ℃靜置培養48 h，于600 nm波長處測定吸光度值，考察菌株FA-1的耐鹽性。

（4）生長曲線繪制

將活化后的菌株FA-1按1%的接種量接種于醬油發酵培養基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養48 h，每隔6 h于600 nm波長處測定吸光度值，繪制菌株FA-1的生長曲線。

1.3.4 不同NaCl濃度的醬油發酵液的制備及其揮發性風味物質分析

不同NaCl濃度的醬油發酵液的制備：將活化后的菌株FA-1在NaCl濃度分別為12%、15%、18%、20%和22%的醬油高鹽培養基中30 ℃靜置培養48 h，得到不同NaCl濃度的醬油發酵液。

取醬油發酵液10 mL，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術對其中的揮發性香氣成分進行測定，以未添加酵母菌的醬油發酵培養基為空白對照。

樣品預處理：吸取2 mL醬油至20 mL的萃取瓶中，加入0.5 g氯化鈉調節離子強度，吸取100 μg/mL內標物3-辛醇溶液10 μL。在50 ℃條件下振蕩40 min，萃取40 min后于氣相色譜儀進樣口解吸5 min，進行GC-MS分析。

氣相色譜（GC）條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純度氦氣（He），流速1 mL/min，采用不分流模式進樣；進樣口溫度250 ℃。程序升溫：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升至100 ℃，然后以6 ℃/min的速度升至220 ℃并保持10 min。

質譜（MS）條件：電子離子（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描模式為全掃描，掃描范圍35～400 amu。

定性定量方法：化合物定性分析以美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）08譜庫檢索結果進行確定，采用內標法（質量濃度為100μg/mL的3-辛醇溶液10 μL）計算各組分的含量。

1.3.5 菌株FA-1在醬油釀造中的應用

采用原池澆淋工藝，將菌株FA-1應用于天津某醬油廠進行生產實驗。其工藝流程如下：

操作要點：豆粕與小麥質量比為6∶4，米曲霉滬釀3.042接種量為0.03%，32～34 ℃培養42 h制備成曲。曲料與18%鹽水的比例為1.0∶2.5（kg∶L）進行發酵，每天澆淋一次，發酵10 d后添加酵母菌培養液（106CFU/mL，添加量100 mL/kg曲料），發酵溫度為42 ℃，共發酵45 d。經淋油、調配、滅菌后，即得醬油。同時，以醬油廠原有酵母菌株As 1.039為對照，采用相同工藝制備醬油。

1.3.6 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據處理，利用Origin 8.0和GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株FA-1的鑒定

2.1.1 菌株FA-1形態特征

菌株FA-1菌落平伏，呈白色奶油狀，顏色均一且不透明，質地粘稠，表面濕潤，邊緣整齊。由圖1可知，FA-1細胞近球形，出芽生殖，直徑（3.5～8.5）μm，不形成假菌絲。

圖1 菌株FA-1的細胞形態Fig.1 Cell morphology of strain FA-1

2.1.2 菌株FA-1生理生化特征

碳源是微生物生長繁殖的重要營養因素。不同的微生物因產生的酶系不同，所能利用的碳源也不相同。采用生長譜法測試菌株FA-1對不同碳源的發酵或同化能力，結果見表1。由表1可知，菌株FA-1可以發酵或同化D-葡萄糖、甘油、D-半乳糖、山梨醇等，不能發酵或同化利用D-棉子糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、側金盞花醇、木糖醇、肌醇、α-甲基-D-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、纖維二糖、D-乳糖（牛源）、D-麥芽糖、D-蔗糖、海藻糖、D-松三糖。

表1 菌株FA-1的碳源利用試驗結果Table 1 Results of carbon source utilization tests of strain FA-1

2.1.3 菌株FA-1分子生物學鑒定

為進一步鑒定菌株FA-1的分類學地位，通過PCR擴增獲得菌株FA-1的26S rDNA序列。將測序結果提交至NCBI，通過BLAST分析，采用MEGA 5.0構建系統發育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株FA-1與魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）聚于同一進化分支，其序列同源性為100%。綜合對菌種的形態學觀察、生理生化特性分析及基因序列的系統發育分析結果，菌株FA-1被鑒定為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。

圖2 基于26S rDNA序列菌株FA-1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain FA-1 based on 26S rDNA sequences

2.2 Z.rouxii FA-1生長特性及耐受性分析

菌株FA-1的生長特性和耐受性分析結果見圖3。由圖3-A可知，當培養溫度在28～32 ℃時，Z.rouxiiFA-1的OD600nm值隨著溫度的升高而上升，當培養溫度在32～42 ℃時，OD600nm值隨著溫度的升高而下降，且當溫度升高至42 ℃，搖瓶發酵24 h時細胞濃度為0，菌株在此溫度下可能出現延遲生長現象[18]。結果表明，Z.rouxiiFA-1的最適生長溫度為32 ℃。

由圖3-B可知，當pH值為3.5～4.0時，OD600nm值隨pH值的增加逐漸升高，當pH值為4.0～6.0時，OD600nm值隨pH值的增加而逐漸降低，結果表明，Z.rouxiiFA-1的最適生長pH值為4.0。醬油發酵過程中pH值在4.5～5.5之間，在此范圍內Z.rouxiiFA-1均可正常生長。

圖3 菌株FA-1的生長特性和耐受性分析Fig.3 Growth characteristics and tolerance analysis of strain FA-1

由圖3-C可知，在NaCl質量分數分別為12%～22%的醬油高鹽培養基中，Z.rouxiiFA-1均能生長。隨著NaCl質量分數的增加，Z.rouxiiFA-1的細胞濃度降低。隨著發酵時間的延長，細胞濃度升高，菌株生長旺盛。當NaCl質量分數分別為20%和22%時，菌株發酵48 h的細胞濃度較發酵24 h時均有所升高，說明Z.rouxiiFA-1對高鹽環境有一定的耐受性，可以在高鹽發酵食品中生長，但細胞增殖速率受到一定程度的抑制，出現延遲生長現象。高鹽稀態醬油的發酵周期為6個月，Z.rouxiiFA-1在高鹽環境下的延遲生長現象并不會對醬油發酵造成影響。

由圖3-D可知，培養0～12 h期間，OD600nm值增長較緩慢，Z.rouxiiFA-1處于延滯期，可能與醬油發酵培養基中較高的鹽濃度（11%）有關；培養12～30 h期間，OD600nm值呈指數級增長，表明Z.rouxiiFA-1逐漸適應高鹽環境后生長旺盛；培養30～48 h期間，OD600nm值趨于不變，表明Z.rouxiiFA-1生長穩定。

2.3 不同NaCl濃度的醬油發酵液中揮發性化合物分析

以未添加酵母菌的醬油發酵培養基為空白對照，采用HS-SPME-GC-MS對NaCl濃度分別為12%～22%的醬油發酵液中揮發性化合物進行檢測，結果見表2。由表2可知，不同NaCl濃度的醬油發酵液中共檢出56種揮發性化合物，包括醇類13種，酚類5種，醛酮類10種，酸類6種，酯類17種以及其他類5種。其中，NaCl質量分數為12%、15%、18%、20%和22%的醬油發酵液中分別檢出45、48、50、51和50種揮發性化合物，對照組中共檢出46種揮發性化合物。

表2 不同NaCl濃度的醬油發酵液中揮發性化合物含量測定結果Table 2 Determination results of volatile compounds contents in soy sauce fermentation broth with different NaCl concentrations

續表

對醬油發酵液中各類揮發性化合物的含量進行分析，結果見圖4。由圖4可知，不同NaCl質量分數的醬油發酵液中醇類化合物的含量最高，且當NaCl質量分數為18%時更有利于醇類化合物的富集，其含量較未添加酵母菌的空白培養基提高了約30倍；當NaCl質量分數為20%時，醬油發酵液中醇類化合物的含量最高，同時含有較高的酯類化合物；當NaCl質量分數為22%時，醇類和酯類化合物的含量均有所降低。因此，將發酵液中NaCl質量分數調整為18%更有助于發揮Z.rouxiiFA-1產醇增香作用。

圖4 不同NaCl濃度的醬油發酵液中各類別揮發性化合物含量分析結果Fig.4 Analysis results of different types of volatile compounds contents in soy sauce fermentation broth with different NaCl concentrations

由表2可知，當醬油發酵液中NaCl質量分數為18%時，醇類的含量為33.60 μg/mL，其中苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、異丁醇和3-甲硫基丙醇等為主，這些醇類形成了醬油的特征風味[19]；研究表明，苯乙醇和3-甲硫基丙醇都是醬油中魯氏接合酵母的關鍵風味代謝物[20]。Z.rouxiiFA-1發酵液中苯乙醇含量最高（39.11%），其具有特殊的玫瑰花香[21-22]，適當提高醬油發酵醪液中苯乙醇的質量濃度，可以顯著提升醬油醇香并改善口感[23]。姚婉婷等[24]通過在魯氏接合酵母培養基中添加硫胺素，提高了苯乙醇的產量。Z.rouxiiFA-1發酵液中含有較高的3-甲基-1-丁醇（38.45%），3-甲基-1-丁醇具有水果和白蘭地香氣[25]。Z.rouxiiFA-1發酵液中乙醇含量為（15.18%），其不僅可以抑制細菌生長，還被認為是醬油醇香的主要來源，參與醬油中酯類物質的形成，共同構成了醬油的基礎香氣[26]。與對照組相比，Z.rouxiiFA-1可顯著提升3-甲硫基丙醇的含量，ZHOU T等[27]研究表明，3-甲硫基丙醇可以有效提升醬油的鮮味。當醬油發酵液中NaCl濃度為18%時，酯類含量為6.37 μg/mL，且乙酸乙酯（8.63%）、乙酸苯乙酯（17.43%）和棕櫚酸甲酯（18.37%）等含量較高。其中，乙酸乙酯具有明顯的水果香氣，高鹽稀態醬油因發酵周期長，更有利于乙酸乙酯的積累[28]。酚類含量為0.38 μg/mL，其中4-乙基愈創木酚的含量最高（52.63%），是各種酒類（白酒、啤酒、葡萄酒）和醬油的重要呈香物質[29-30]。

綜上，Z.rouxiiFA-1具有良好的產醇增香性能，可以應用于醬油生產過程中，改善產品風味和品質。

2.4 Z.rouxii FA-1在醬油釀造中的應用

以酵母As 1.039為對照，采用Z.rouxiiFA-1釀造醬油。對兩種醬油中的揮發性風味化合物進行GC-MS分析，結果見表3。由表3可知，兩種醬油共檢測出103種揮發性風味化合物，其中添加Z.rouxiiFA-1的醬油中共檢測出92種揮發性化合物，總含量為3 174.95 μg/L，包括醇類19種（2 286.86 μg/L）、酚類3種（27.53 μg/L）、醛酮類11 種（102.13 μg/L）、酸類7種（38.63 μg/L）、酯類41種（663.41 μg/L）和其他類11種（56.39 μg/L）；添加酵母As 1.039的對照組中共檢測出71種揮發性化合物，總含量為1 468.32 μg/L，包括醇類17種（989.77 μg/L）、酚類4種（38.01 μg/L）、醛酮類13種（138.40 μg/L）、酸類8種（47.76 μg/L）、酯類21種（229.04 μg/L）和其他類8種（25.34 μg/L）。

結合表3可知，Z.rouxiiFA-1釀造醬油中醇類占72.03%，且醇類化合物的含量較對照組提高131.05%。醇類中苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇的含量較高，這與Z.rouxiiFA-1在不同NaCl濃度的醬油發酵液中香氣物質分析的結果一致，表明Z.rouxiiFA-1在復雜的醬油發酵過程中依然能發揮其優良的產醇特性。醇類物質可賦予醬油特有的醇香風味，同時作為酯化反應的前體物質在醬油長期發酵過程中與有機酸等形成酯類物質，是醬油香氣成分的重要組成。

表3 兩種醬油揮發性風味物質成分含量測定結果Table 3 Determination results of volatile compounds contents in two kinds of soy sauce

續表

除醇類之外，添加Z.rouxiiFA-1的實驗組中酯類較對照組增加20種，含量增加189.65%。酯類是發酵食品中最重要的香氣來源之一，具有良好的揮發性且人的嗅覺受體對其敏感度較高[31]。如有濃烈而甜的蜂蜜香氣的苯乙酸乙酯，是醬油香味的主要貢獻者之一[32-33]；還有水果香的辛酸乙酯和苯甲酸乙酯；葡萄香的癸酸乙酯以及花果香的十二酸乙酯等酯類化合物有助于豐富醬油的香氣成分[34]。因此，Z.rouxiiFA-1可作為產香酵母應用于醬油發酵領域。

3 結論

對醬醪中篩選的耐鹽產香酵母菌FA-1進行鑒定，經形態觀察、生理生化及分子生物學鑒定為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）。當NaCl質量分數為22%時Z.rouxiiFA-1仍能生長，表明此菌株對高鹽環境有較好的耐受性，可以在高鹽發酵食品中生長。Z.rouxiiFA-1在不同NaCl質量分數的醬油發酵液中共檢出56種揮發性風味物質，且當NaCl質量分數為18%時，更有利于醇類化合物的富集。為驗證Z.rouxiiFA-1在醬油發酵過程中對產品風味的改善，以添加酵母As 1.039為對照組進行醬油成品的制備，結果表明，添加Z.rouxiiFA-1的醬油成品中醇類物質占比最大（72.03%），其中苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇的含量較高，且醇類和酯類化合物的含量分別較對照組提高131.05%和189.65%，有助于豐富醬油香氣成分和改善產品品質。綜上，Z.rouxiiFA-1具有良好的耐鹽產香性能，適合在醬油釀造領域作為優良產香菌株應用。