基于第三代測序與理化指標評價不同壓曲工藝醬香大曲品質

唐佳代，趙益梅*，冉光耀，王芙蓉，孟卓妮，龍亞飛，胡 娜

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

醬香大曲是醬香型白酒生產所需的糖化發酵劑，在釀造過程中起到糖化、生香及投料等作用[1]。目前，大部分企業生產醬香大曲仍然秉承傳統釀造工藝，即人工踩曲，其生產成本高，生產效率較低。隨著科技進步，機械化釀造醬香型白酒已成為發展趨勢，發展安全高產的機械化釀造模式勢在必行。醬香型白酒機械化生產多集中在高溫制曲工藝環節，傳統醬香大曲是將曲料倒入模具中，經人工踩制而成。機械仿生壓曲采用自動控制系統，對曲塊壓制成型進行實時監控[2]。傳統人工踩曲與機械仿生壓曲兩種不同的壓曲工藝生產的醬香大曲中的微生物種類、理化指標以及發酵性能存在差異[3]。有研究表明，不同壓曲工藝大曲的特性影響白酒的品質，因此，解析其中微生物群落和理化指標有助于評價醬香大曲品質，并對醬香型白酒機械化釀造發展具有重要意義[4-6]。

基于基因組學技術直接研究其中微生物群落的全部微生物，無需分離單菌株，從而打破了大部分釀造微生物不可培養引起的對微生物群落片面化的研究局面[7]。相比于第一代測序技術成本高、速度慢、通量低，第二代測序技術通量較高，但讀長短，僅為30～450 bp，且擴增易發生錯配。第三代測序技術是一種具有成本低、速度快、通量高及讀長長等優點的測序技術[7]。目前，常見的第三代測序技術為Oxford Nanopore的納米孔單分子、單分子脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測序、單分子實時測序技術[8]。Oxford Nanopore納米孔單分子技術解鏈與測序同時進行，該技術的核心為核酸外切酶與α-溶血素納米孔相耦合，且為保證監測到每個堿基，需控制堿基穿過5 nm的納米孔的速度在1核苷酸/ms[9]。該技術特點是無需聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，避免堿基發生替換、偏置，且隨著測序深度增加及更正軟件的使用準確率可達到99.9%[10]。

本研究采用納米孔單分子測序技術分析不同壓曲工藝醬香大曲中微生物群落結構，結合理化指標評價機械仿生壓曲與傳統人工踩曲成品曲的品質，以期掌握更多醬香型白酒中的微生物信息，為推進機械化生產醬香型白酒奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

機械仿生壓曲AQ、傳統人工踩曲MQ：貴州省赤水河流域某酒廠成品曲（貯存時間為6個月）。取樣時間為2022年1月，該酒廠制曲車間中3個曲倉中成品曲各一塊，粉碎混合后用四分法進行縮分取樣，備用。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：天津大茂化學試劑廠；硫酸（分析純）：川東化工集團；己酸、乙醇、乙酸（均為分析純）：上海滬試實驗室器材股份有限公司；乙酸鈉（分析純）：南京化學試劑股份有限公司；DNA提取試劑盒：美國Zymo Research BIOMICS公司；MegaFi Fidelity DNA Polimerase：加拿大Applied Biological Materials Inc公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA1204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-8J數顯恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司；DK-98-Ⅱ電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫療股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同壓曲工藝醬香大曲理化特性分析

按照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[11]對醬香大曲的水分含量、酸度、糖化力和淀粉含量進行測定。

1.3.2 不同壓曲工藝醬香大曲微生物群落的高通量測序

機械仿生壓曲、傳統人工踩曲兩種壓曲工藝的醬香大曲樣品送至成都羅寧生物科技有限公司，使用DNA提取試劑盒提取樣品中的DNA，以其為模板，采用引物ITS1（5'-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-AGCCTSCSCTTANTDATATGC-3'）PCR擴增真菌內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）基因序列；采用引物8F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增細菌的16S rDNA區域基因序列。真菌PCR擴增體系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）0.5 μL，GSS Depletion Mix 2 μL，上游引物ITS3 1 μL，下游引物ITS4 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超純水13 μL。細菌PCR擴增體系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上游引物8F 1 μL，下游引物1492R 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超純水15 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共25～30個循環；72 ℃再延伸2 min；4 ℃保溫。PCR擴增產物純化后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，每個樣本進行3次重復，取線性期PCR產物等量混合后建庫。采用MinION Flow Cell測序試劑盒、Nanopore GridION Mk1測序儀測序。

1.3.3 高通量測序數據處理與分析

高通量測序所得序列通過使用NanoFilt去除、過濾掉低質量序列，基于Uchime算法和gold數據庫去除嵌合體，得到有效數據（effiective tag）。使用生信物種注釋軟件Kraken2（http：//ccb.jhu.edu/software/kraken2/）對每一條序列進行物種注釋，并統計物種數目。基于UNITE數據庫（8.2）和SILVA數據庫（138）進行基因序列比對和注釋分析。使用Kraken2軟件進行k-mer比對算法，直接進行物種注釋：首先將序列切成若干k-mer；再將k-mer比對到物種分類數據庫上獲得其最低共同祖先（lowest common ancestor，LCA）；最后將相同的種，即操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進行合并統計，本研究沿用第二代測序以OTU作為一類高相似性序列集合的描述方式，但每個OTU對應每個種。使用R語言（3.6.0）對樣品Alpha多樣性指數進行分析，用于衡量Alpha多樣性的指標主要有Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數。Chao1指數用于衡量樣本中物種的豐度，其數值與樣本物種總數成正比[12]。Shannon和Simpson指數用于綜合衡量樣本物種多樣性[13]，其數值越大代表群落多樣性越高。

2 結果與分析

2.1 不同壓曲工藝醬香大曲理化特性分析

醬香大曲主要起到糖化、發酵、投糧和增香等作用[14]。生產實踐中，醬香大曲的酸度、糖化力、水分和淀粉含量常作為重要的理化指標，用于衡量大曲品質[15]。大曲酸度應在0.10～0.35 mmol/g范圍，適宜的酸度能夠抑制雜菌生長，并為酯化反應提供前體物質[16]。酸度主要受產酸微生物代謝、脂肪與蛋白質水解程度影響，酸度過高或過低均不利于釀造微生物生長繁殖[15]。糖化力指大曲中的淀粉酶將釀造原料中的淀粉水解為可發酵性糖類的能力，糖化力過高淀粉水解率增加，可能導致堆子升溫增快，從而不利于發酵，糖化力應為（100～300）U[16]。醬香大曲水分含量需＜13%，既要保證微生物生長繁殖，又要避免因水分含量過高導致大曲發霉變質[14]。地方標準DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》中規定醬香大曲中淀粉含量應為53%～60%，大曲中淀粉在醬香型白酒多輪次發酵中起投糧作用[16]。不同壓曲工藝醬香大曲的理化指標見表1。

表1 不同壓曲工藝醬香大曲的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of sauce-flavor Daqu with different molding processes

由表1可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品的水分含量、酸度與淀粉含量均符合地方標準DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》[16]。傳統人工踩曲MQ水分含量顯著高于機械仿生壓曲AQ（P＜0.05），大曲水分含量越高越不易貯存；機械仿生壓曲AQ的糖化力和淀粉含量均顯著高于傳統人工踩曲MQ（P＜0.05），機械仿生壓曲AQ能夠起到更好的糖化作用和投糧作用；機械仿生壓曲AQ的酸度略低于傳統人工踩曲MQ，分別為2.3 mmol/g、3.0 mmol/g，但無顯著差異（P＞0.05）。綜上所述，通過機械仿生壓曲制備的醬香大曲AQ品質優于傳統人工踩曲的醬香大曲MQ。

2.2 不同壓曲工藝醬香大曲微生物菌群測序結果分析

從不同壓曲工藝醬香大曲樣品中提取基因組DNA后，分別對ITS（16S rDNA）區基因序列進行測序，通過雙端拼接、過濾嵌合體后共獲得70 826條（45 631條）有效序列，平均堿基長度為525 bp（1 379 bp）。基于檢測到的菌種繪制韋恩圖，結果見圖1。由圖1a可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品共有63個真菌菌種，機械仿生壓曲AQ樣品特有菌種為4個，序列數之和在總菌種的序列數中所占的比例為0.03%，傳統人工踩曲MQ中真菌菌種在機械仿生壓曲AQ樣品中均存在。由圖1b可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品中共有272個細菌菌種，機械仿生壓曲AQ和傳統人工踩曲MQ樣品特有細菌菌種分別為29個和26個，這些菌種的序列數之和在總菌種的序列數中所占的比例分別為0.18%、0.17%。結果表明，機械仿生壓曲AQ樣品中微生物菌種數多于傳統人工踩曲MQ樣品，且具有傳統人工踩曲MQ樣品中的所有真菌菌種。

圖1 不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌（a）及細菌（b）菌群的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of fungal (a) and bacterial (b) flora in sauceflavor Daqu samples with different molding processes

為了探索樣本物種豐富度隨測序深度的變化趨勢，從不同壓曲工藝醬香大曲樣品中隨機抽取一定數量序列數與序列所代表的物種數目，以抽取的一系列序列數和相應的物種數繪制稀釋曲線，結果見圖2。

圖2 不同壓曲工藝醬香大曲的物種數稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of species number of sauce-flavor Daqu with different molding processes

由圖2可知，機械仿生壓曲AQ和人工踩曲MQ樣品的稀釋曲線前期急劇上升，隨著抽取序列數的增加后趨于平緩。結果表明，前期隨著抽取序列數的增加，檢出大量物種；當抽檢數量達到15 000條序列后，物種不再隨測序數量增加而顯著增加，表明樣本測序量充分，測序結果能真實反映不同壓曲工藝醬香大曲的微生物多樣性。

2.3 不同壓曲工藝醬香大曲微生物菌群多樣性分析

不同壓曲工藝醬香大曲樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析結果分別見表2及表3。由表2及表3可知，各醬香大曲樣本的Coverage數值均＞0.999，說明測序結果能夠真實的反映樣品物種豐度及物種多樣性[17]。在不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌和細菌菌群Alpha多樣性指數中，機械仿生壓曲AQ樣品的Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均較高，說明機械仿生壓曲AQ中物種分布較傳統人工踩曲MQ更均勻、菌群多樣性更高。

表2 不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌菌群的Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of fungal flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes

表3 不同壓曲工藝醬香大曲樣品細菌菌群的Alpha多樣性分析結果Table 3 Alpha diversity analysis results of bacterial flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes

2.4 不同壓曲工藝醬香大曲微生物群落結構分析

從機械仿生壓曲AQ與傳統人工踩曲MQ醬香大曲樣品中共檢測到63個真菌種，其中，相對豐度＞0.1%的真菌菌種見圖3a。由圖3a可知，兩種大曲樣品中相對豐度較高的菌種均為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）（0.34%；0.46%）、微皺籃狀菌（Talaromyces rugulosus）（0.16%；0.15%）、米曲霉（Aspergillus oryzae）（0.19%；0.10%）。傳統人工踩曲MQ醬香大曲樣品中檢出的真菌均在機械仿生壓曲AQ醬香大曲樣品中檢出。

從機械仿生壓曲AQ與傳統人工踩曲MQ醬香大曲樣品中共檢測到272個細菌種，相對豐度排前20的細菌菌種見圖3b。由圖3b可知，兩樣品中相對豐度排前10的物種均為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）（7.22%；6.78%）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）（3.90%；4.38%）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）（3.92%；4.00%）、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）CC6-YY-74（3.12%；3.18%）、防御假單胞菌（Pseudomonas protegens）（2.70%；2.47%）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）（2.12%；2.56%）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（2.15%；2.20%）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（2.11%；2.00%），Pseudomonas silesiensis（1.87%；1.89%），貪噬菌屬（Variovoraxsp.）PMC12（2.04%；1.70%）。機械仿生壓曲AQ醬香大曲樣品中特有的相對豐度較高（相對豐度＞0.02%）的細菌種為普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、Pseudomonas cerasi和人類產堿菌（Paenalcaligenes hominis）；傳統人工踩曲MQ醬香大曲樣品中特有的相對豐度較高（相對豐度＞0.02%）的細菌種為魏格沃斯菌（Wigglesworthia glossinidia）、發酵氨基酸球菌（Acidaminococcus fermentans）和Alteromonas australica。

圖3 基于種水平上不同壓曲工藝醬香大曲樣品的微生物群落結構Fig.3 Microbial community structure of sauce-flavor Daqu samples with different molding processes based on the species level

3 討論

醬香型大曲的糖化力是保證醬香型白酒“多輪次”取酒和確保酒質穩定的關鍵，糖化力在300 U以下時，糖化力越高且淀粉含量高代表大曲能夠將更多的淀粉水解為能夠被微生物利用的可發酵性糖類[17]。醬香大曲的糖化力高低與大曲中微生物群落結構息息相關[18]，醬香大曲微生物群落結構相關研究證實曲霉屬（Aspergillus）是醬香大曲中種類最為豐富的霉菌，可產生淀粉酶、糖化酶和纖維素酶等水解酶類[19-22]，糖化微生物的結構與醬香大曲中糖化力相關[23-25]。本研究結果表明，傳統人工踩曲MQ與機械仿生壓曲AQ中相對豐度較高的真菌種均為曲霉屬（Aspergillus），包括煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和米曲霉（Aspergillus oryzae），其中Aspergillus fumigatus具有較高的纖維素降解能力[26]，Aspergillus oryzae在醬香型白酒發酵過程中被證實為糖化菌株[27]。機械仿生壓曲AQ的糖化力高于傳統人工制曲，該結果與機械仿生壓曲AQ中物種分布更均勻、菌群多樣性更高相關。

4 結論

本研究采用第三代測序技術分析對比不同壓曲工藝醬香大曲的微生物群落結構，并以理化指標為依據對比分析了不同壓曲工藝醬香大曲品質。傳統人工踩曲MQ水分含量顯著高于機械仿生壓曲AQ（P＜0.05）；機械仿生壓曲AQ的糖化力和淀粉含量顯著高于傳統人工踩曲MQ（P＜0.05），機械仿生壓曲AQ的酸度與傳統人工踩曲MQ相近（P＞0.05），綜合來看，機械仿生壓曲AQ的糖化與投糧作用優于傳統人工踩曲MQ，且機械仿生壓曲AQ水分含量較低更易貯存。

不同壓曲工藝醬香大曲樣品中共發現63個真菌和272個細菌菌種，機械仿生壓曲AQ樣品特有菌種為4個，其余59種真菌在傳統人工踩曲MQ與機械仿生壓曲AQ樣品中均被檢出。機械仿生壓曲AQ和傳統人工踩曲MQ樣品特有細菌菌種分別為29個和26個。在Alpha多樣性指數中，機械仿生壓曲AQ樣品的Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均較高。機械仿生壓曲AQ中物種分布較為均勻、檢測出物種總數較高，且真菌與細菌群落多樣性和總數均高于傳統人工踩曲MQ。通過在UNITE和SILVA分類學數據庫比對，在不同壓曲工藝醬香大曲樣品中鑒別出相對豐度較高的真菌種均為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、微皺籃狀菌（Talaromycesrugulosus）和米曲霉（Aspergillusoryzae）；相對豐度較高的細菌種均為丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）CC6-YY-74、防御假單胞菌（Pseudomonas protegens）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、Pseudomonas silesiensis、貪噬菌屬（Variovoraxsp.）PMC12。綜合理化指標和微生物群落結構結果，機械仿生壓曲AQ的品質要高于傳統人工踩曲MQ。

基于第三代測序技術與理化指標測定，初步掌握不同壓曲工藝醬香大曲中微生物菌種概況，對比分析機械仿生壓曲與傳統人工踩曲生產的醬香大曲品質。進一步將開展不同壓曲工藝醬香大曲中微生物組學與酶學、風味組的相關性研究，并為微生物資源開發利用奠定理論基礎。