新疆天山北麓產區‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣成分分析

喬 丹，楊 濤，艾麗菲熱·庫爾班江，龔婭軍，陳衛林，張珍珍

（新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

‘小芒森’（Petit Manseng），又稱小滿勝、佩特蒙森，在眾多的釀酒葡萄品種之中，‘小芒森’成熟期晚，掛果時間長，是一種高糖、高酸的釀酒葡萄品種，是釀造天然甜酒的理想品種[1-2]。一般認為，來源于釀酒果實的品種香帶有明顯的品種和產地特征，這都決定著葡萄酒的風格，品種香又根據其代謝路徑分為源于脂肪酸的C6/C9化合物、源于異戊二烯的萜烯類和降異戊二烯類化合物，以及源于氨基酸的芳香族類和甲氧基吡嗪等[3-5]。有研究表明，香氣化合物主要存在葡萄果實內表皮中，在葡萄果實成熟階段會受到成熟進程的調控[6-8]。

目前‘小芒森’在我國的膠東半島產區已有種植，其在該地區的品質表現已有報道[1-2，9]。而‘小芒森’引種到新疆天山北麓產區的時間不長，目前只在五家渠中糧長城和瑪納斯中信國安葡萄酒業有限公司葡萄種植基地種植，眾所周知，新疆天山北麓產區的氣候特征明顯區別于其他產區，如日照時間長、降雨量少、晝夜溫差大等[10-11]，這些因素都會影響葡萄果實的成熟進程，進而影響葡萄果實的品質[12-13]，主要包括顏色和香氣品質[13-16]。任瑞華等[17]研究發現，以‘小芒森’為試材，從花后30 d開始直至完全成熟進行采樣，其可溶性固形物含量和pH隨著果實生長逐漸增大，而可滴定酸、總酚和總單寧含量呈降低趨勢。周鵬輝等[9]研究發現，小芒森在蓬萊產區適宜的采收期是在葡萄果實糖度達到290 g/L以上，總酸在9 g/L左右，此外如果氣候條件允許，繼續推遲采收，果粒開始萎縮，出汁率下降，導致總糖上升，其香氣成分也將發生變化。目前關于新疆地區‘小芒森’葡萄果實品質特性研究的報道很少。

本研究以新疆天山北麓產區這一特定地域環境下的‘小芒森’葡萄品種為研究對象，分別測定五家渠和瑪納斯地區葡萄果實生長過程中的理化指標，通過頂空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術檢測其香氣物質的組成及含量，并采用偏最小二乘法-判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）判斷果實香氣物質組成及含量差異，以期為‘小芒森’葡萄品種的栽培提供一定參考，進一步為更好地發揮其在新疆地區的利用價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘小芒森’釀酒葡萄果實均來源于天山北麓產區。‘小芒森’葡萄：五家渠中糧長城葡萄種植基地，樹齡為12年，畝產800 kg。‘小芒森’葡萄：瑪納斯中信國安葡萄種植基地，樹齡為8年，畝產600 kg。兩地區都采用南北走向，“廠”字型架勢的種植模式。采樣從盛花期花后第8周開始，每周采樣一次，直至第13周采樣結束，采樣時消除邊際效應，兼顧陰陽面，葉幕層內外和上中下果穗，以及每穗葡萄肩、中、頂部，分散隨機采取葡萄果實。新鮮果實用于測定葡萄果實理化指標，其他用液氮速凍，放到-40 ℃冰箱中待用。

NaCl、NaOH、葡萄糖、二氯甲烷（均為分析純）、二氯甲烷、甲醇（均為色譜純）、4-甲基-2-戊醇（色譜純）：北京化學試劑公司；D-葡萄糖酸內酯、聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（純度≥99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16A型高速臺式離心機：北京世紀科信科學儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海星宋科學儀器有限公司；HZS-H型水浴恒溫振蕩器：上海思爾達科學儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵：鄭州華特儀器設備有限公司；Agilent 7890氣相色譜儀、Agilent 5975B質譜儀：美國安捷倫科技公司；聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB）萃取頭：北京康林科技有限責任公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（150 mg/6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司；PAL-2手持折光儀：日本ATAGO公司；JYL-C93T榨汁機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果實理化指標的測定

樣品預處理：50 g葡萄果實破碎后擠汁，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。采用手持折光儀測定可溶性固形物含量；采用酸堿滴定法測定可滴定酸含量。

1.3.2 葡萄果實香氣物質的提取

參照楊曉帆[14]的頂空固相微萃取（HS-SPME）方法提取葡萄果實香氣物質。100 g葡萄果實去梗去籽碾碎之后在液氮保護下加入0.5 gD-葡萄糖酸內酯和2 g聚乙烯基聚吡咯烷酮，用打粉機打成粉末裝入50mL離心管中放入4℃冰箱內靜置浸提4 h，然后于4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，得到澄清的葡萄汁。之后吸取5 mL葡萄汁于15 mL的樣品瓶中，再加入1 g NaCl和10 μL內標（4-甲基-2-戊醇，質量濃度1.038 8 g/L的水溶液）：將裝有葡萄汁的樣品瓶放置在磁力攪拌加熱臺上于40 ℃下保持30 min，將已活化過的萃取頭插入樣品瓶的頂部，萃取頭與樣品液面保持1 cm距離，在250 ℃的條件下熱解吸8 min，待GC-MS分析[14]。每個樣品均做3次獨立的重復。

1.3.3 葡萄果實香氣物質的測定

GC-MS分析：葡萄果實香氣化合物的分析使用氣相色譜-質譜儀，載氣為高純氦氣（He）；流速1 mL/min；柱溫箱在50 ℃保持1 min后以3 ℃/min的速度升溫至220 ℃，之后保持5 min；質譜接口和離子源的溫度分別為280 ℃和230 ℃，選擇電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為20～350 u[14，18]。

定性和定量分析：對于已有標準品的香氣物質根據相同色譜條件下該化合物的保留指數和離子碎片進行定性分析[14，18]。以4-甲基-2-戊醇為內標物，利用其獲得的相應物質的標準曲線回歸方程對已有標樣的香氣物質進行定量，利用化學結構相似、碳原子數相近的標準品的標準曲線回歸方程對沒有標樣的香氣物質進行半定量[14，18]。

1.3.4 數據處理

本研究采用Microsoft Office Excel 2019進行數據及圖表整理；運用SPSS 19.0進行數據統計分析；采用Metabo-Analyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 不同成熟階段‘小芒森’葡萄果實理化指標的測定結果

‘小芒森’葡萄果實成熟過程中可溶性固形物和可滴定酸含量測定結果見圖1。

葡萄果實中糖分是諸多指標的基礎，決定著葡萄酒的酒度[19-20]。有研究認為，在干旱和半干旱地區，較少降雨量以及強光照使果實糖分迅速積累，成熟速度比其他地區有所加快，果實品質會受到影響[5，21]。由圖1A可知，五家渠、瑪納斯地區的‘小芒森’葡萄果實可溶性固形物含量均隨著果實成熟呈上升的趨勢。從花后第8周至花后第13周，隨著果實成熟，瑪納斯地區葡萄果實可溶性固形物含量的增長幅度較大，在果實采收時，可溶性固形物含量高于五家渠地區葡萄，達到了30.10°Bx，五家渠地區葡萄可溶性固形物含量為27.47°Bx。

葡萄果實中可滴定酸的含量主要是在綠果期大量積累，隨著果實的成熟可滴定酸含量逐漸降低。由圖1B可知，可滴定酸含量總體呈現逐漸降低的趨勢。在花后第8周，五家渠、瑪納斯地區的‘小芒森’葡萄果實可滴定酸含量均為最高值，其值分別為38.11 g/L、28.93 g/L。在花后13周果實采收時，五家渠地區的為11.91 g/L，瑪納斯地區葡萄果實可滴定酸含量為10.67 g/L。

圖1 ‘小芒森’葡萄果實成熟過程中可溶性固形物（A）和可滴定酸（B）含量測定結果Fig.1 Determination results of soluble solid (A) and titratable acid (B) contents of 'Petit Manseng' grape fruit during ripening process

2.2 ‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣成分分析

‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣化合物GC-MS分析結果見表1。由表1可知，兩地區葡萄果實成熟過程中香氣成分共檢出46種，其中，醇類10種，醛類16種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類6種。以醛類和醇類為主，并含有少量酯類、酸類、酮類和烯類及苯類物質，五家渠地區‘小芒森’葡萄果實成熟過程中可檢測到香氣化合物43種，主要包括醇類9種，醛類16種，酯類2種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類5種。瑪納斯地區‘小芒森’葡萄果實成熟過程中可檢測到香氣化合物42種，包括醇類10種，醛類15種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類4種，苯類5種。在花后第13周果實成熟采收時，兩地區共有的香氣成分有35種，香氣物質的種類組成差異物質11種，包括4-萜烯醇、2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇、乙酸葉醇酯、雙戊烯、1,4-二氯苯、辛醛、E-2,6-壬二醛、鄰甲基苯乙烯、苯乙烯、對二甲苯、1-辛烯-3-酮。

表1 不同地區‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣化合物GC-MS分析結果Table 1 Results of aroma compounds in 'Petit Manseng' grape fruit in different areas during ripening process analyzed by GC-MS

續表

續表

2.3 ‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣成分的變化

隨著‘小芒森’葡萄果實的成熟，兩個地區的‘小芒森’葡萄果實香氣化合物均整體呈現上升的趨勢，花后第13周，五家渠地區葡萄香氣物質總含量為57 749.58 μg/L，瑪納斯地區明顯低于五家渠地區，為32 828.59 μg/L。在五家渠地區，花后第13周葡萄果實中香氣化合物總含量是花后第8周的3.8倍，而同生長期的瑪納斯地區的‘小芒森’葡萄果實香氣化合物含量則是2.9倍，在成熟過程中五家渠地區的葡萄果實香氣化合物的積累速率高于瑪納斯地區。通過監測葡萄果實成熟過程中的可溶性固形物含量發現，果實成熟后期（花后12周到花后13周），可溶性固形物含量積累速度雖次于成熟早期（花后8周到花后10周），但是香氣化合物含量一直保持快速積累的狀態，也有研究發現，香氣化合物的積累量與果實成熟度不完全相關[22-23]。進一步對‘小芒森’葡萄果實中各類香氣成分的變化進行具體分析。

2.3.1 醇類物質的變化

在瑪納斯地區，葡萄果實中10種醇類物質均可檢出，隨著果實成熟，3-己烯-1-醇含量變化整體呈下降的趨勢，而己醇呈先下降后上升的趨勢，花后第13周，其含量分別為5.705 μg/L，282.76 μg/L；在五家渠地區，花后第8周和第9周未檢出E-2-己烯-1-醇、己醇，花后第11周后未檢出4-萜烯醇，成熟過程中均未檢出2,6-二甲基-5,7-辛二烯-2-醇；具有清草香的E-2-己烯-1-醇、苯甲醇及己醇含量變化整體呈上升趨勢[24]，花后第13周，這3種物質的含量分別為209.042 μg/L、74.448 μg/L、926.613 μg/L。

2.3.2 醛類物質的變化

在瑪納斯地區，花后第11周未檢出辛醛，整個成熟期未檢出E-2,6-壬二醛；具有綠葉清香的己醛、E-2-己烯醛含量明顯上升[24]，花后第13周，這2種物質的含量分別為26 497.742 μg/L、2 997.057 μg/L。在五家渠地區，花后11周可檢出甜花香的苯乙醛，而己醛、E-2-己烯醛含量明顯上升，花后第13周，這2種物質的含量分別為50 653.17 μg/L、3 035.452 μg/L。這些醛類化合物在葡萄酒中主要呈‘綠葉’‘青草’氣味，是由不飽和脂肪酸經過脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）以及乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）等催化產生[25]，在‘赤霞珠’品種中的含量很高。丁燕等[26]分析了蓬萊產區的小芒森葡萄果實中香氣物質組成及含量，也發現醛類物質是葡萄果實中檢測出的最豐富的一類物質。

2.3.3 酯類物質的變化

乙酸葉醇酯含量在果實成熟過程中整體呈先下降后上升的趨勢，花后第13周，其在瑪納斯地區葡萄果實中含量為182.901 μg/L，而其在五家渠地區葡萄果實未檢出，它在葡萄酒中主要呈青草香以及香蕉氣味[27]。而在兩個地區，甲基丙烯酸己酯和水楊酸甲酯含量變化均不明顯。

2.3.4 酮類物質的變化

在瑪納斯地區葡萄果實中，1-辛烯-3-酮在花后11周之后未檢出，β-大馬士酮在花后第13周略有降低，含量為9.556 μg/L。而五家渠地區葡萄果實中，1-辛烯-3-酮整體呈先升高后下降的趨勢，花后第13周，其含量為8.294 μg/L，β-大馬士酮呈上升趨勢，花后第13周，其含量為12.035 μg/L。這些物質主要為葡萄酒貢獻花香和果香，其中β-大馬士酮也是降異戊二烯類香氣化合物中主要的組分[13]。

2.3.5 酸類物質的變化

在瑪納斯地區，葡萄果實成熟過程中乙酸含量整體呈下降趨勢，花后第13周，其含量為1 582.818 μg/L，而五家渠地區，乙酸含量在葡萄果實成熟過程中呈上升趨勢，果實成熟時，其含量為1 762.108 μg/L。乙酸在葡萄酒中主要呈刺激、尖酸的氣味，因此，有研究利用本土戴爾有孢圓酵母R12與釀酒酵母NX11424同時接種和順序接種發酵，來降低甜型葡萄酒中的乙酸，進一步增加其香氣復雜度[28]。

2.3.6 烯類物質的變化

在瑪納斯地區，Z-4-蒈烯在果實發育過程中有所下降，花后第13周，其含量為3.391 μg/L，鄰甲基苯乙烯、苯乙烯未檢出，其他物質含量變化不明顯。在五家渠地區，松油烯、Z-4-蒈烯、鄰甲基苯乙烯在果實成熟過程中有所下降，此外，雙戊烯在花后11周后葡萄果實中未檢出。其中，雙戊烯又稱檸檬烯，在葡萄酒中呈現柑桔香、檸檬香[24]。

2.3.7 苯類物質的變化

在瑪納斯地區，乙基苯、鄰-異丙基甲苯的含量在葡萄果實成熟采收時有所增加，其他物質變化不明顯，對二甲苯未檢出。而在五家渠地區，乙基苯在葡萄果實成熟采收時有所增加，花后第13周，其含量為11.291 μg/L，鄰-異丙基甲苯含量有所下降，1,4-二氯苯在成熟過程中均未檢出。

2.4 ‘小芒森’葡萄香氣成分的偏最小二乘法-判別分析

為了更加直觀反映五家渠和瑪納斯地區‘小芒森’葡萄成熟過程中果實香氣物質的差異，進行了偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），結果見圖2。由圖2A可知，PLS-DA在提取出來的2個主成分中，主成分1和主成分2累積方差貢獻率為96.1%，可基本反映出樣品中的香氣物質信息，隨果實成熟，瑪納斯地區樣品點的分布從X軸的負半軸向正半軸排列，對于五家渠地區，雖然其樣品點分布隨果實成熟未呈現規律性分布，但部分的樣品點與瑪納斯地區可以較好地分離。由圖2B可知，通過變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0，確定導致兩地區葡萄果實組分含量差異的主要物質為己醛（b2）、E-2-己烯醛（b4）、乙酸（e1）、己醇（a9）。

圖2 五家渠和瑪納斯地區‘小芒森’葡萄果實成熟過程中香氣化合物的偏最小二乘法-判別分析結果Fig.2 Partial least squares-discriminant analysis results of aroma compounds during ripening process of 'Petit Manseng'grape fruit in Wujiaqu and Manas regions

3 結論

在新疆天山北麓產區，持續的高溫會加快‘小芒森’葡萄果實的成熟。隨著果實的成熟，可溶性固形物含量整體呈上升趨勢，而可滴定酸含量呈下降趨勢，香氣化合物總量呈現上升的趨勢。五家渠、瑪納斯地區葡萄果實在成熟過程中共檢出香氣物質46種，其中，醇類10種，醛類16種，酯類3種，酮類4種，酸類1種，烯類6種，苯類6種，以醛類、醇類物質為主。花后第13周，兩地區葡萄果實共有香氣成分有35種，通過偏最小二乘法-判別分析發現，葡萄成熟過程中香氣物質的組分含量差異主要在于己醛、E-2-己烯醛、乙酸、己醇。本研究為認識新疆天山北麓地區‘小芒森’葡萄果實香氣品質表現特性提供了依據，更好地發揮其在新疆地區的利用價值。