植物乳桿菌對淫羊藿黃酮苷類成分的轉化作用

謝炎福，押輝遠，張新雨，樊悅君，趙 冰，王瑞鴿，楊紫怡

（洛陽師范學院 食品與藥品學院，河南 洛陽 471934）

淫羊藿（Epimedium brevicornuMaxim.）具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的作用，常用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨萎軟、風濕麻痹、麻木拘攣等病癥，其主要活性成分為具異戊烯基取代的黃酮類化合物[1]，淫羊藿中的黃酮類化合物主要以多糖苷、雙糖苷、單糖苷的形式存在，淫羊藿多糖苷黃酮滲透性差，吸收利用率低，單糖苷和苷元的的生物活性是多糖苷的數十倍[2]。但淫羊藿中多糖苷黃酮數量多、含量高，低糖苷尤其是單糖苷和苷元含量低，采用綠色安全的方法將淫羊藿中大量的多糖苷類成分轉化為更具活性的低糖苷或苷元成為現在的研究熱點問題之一[3]。

淫羊藿經傳統油炙炮制后可以提高淫羊藿苷、淫羊藿次苷的含量[4-5]，該方法需高溫，不同溫度油炙后成分差異巨大。蔣艷榮等[6-7]分別利用β-葡萄糖苷酶、蝸牛酶將淫羊藿苷轉化為苷元和寶藿苷I，酶解法環境友好，常溫常壓下即可完成，但酶的成本高昂。谷春秀等[8]用黑曲霉固態發酵淫羊藿后，淫羊藿苷含量得到大幅提高，顯示出生物發酵法在淫羊藿活性成分轉化方面的巨大潛力。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）能產生蛋白酶，葡萄糖苷酶等豐富的酶系，能有效破除植物類中藥細胞壁和果膠類物質形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，且具有打斷β糖苷鍵，將多糖苷轉化為單糖苷和苷元的潛力[9-10]。超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）已被廣泛應用于食品、藥品、化妝品等化學成分的快速鑒定，可通過將液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）掃描的碎片離子信息和化合物裂解規律與對照品或文獻比對來快速、準確地分析化合物中所含化學成分。淫羊藿中不同母核結構的化學成分在電噴霧電離質譜（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）法中有不同的特征碎片，可根據碎片離子特征和裂解規律鑒定其所含的化學成分[11]。目前，中藥的生物轉化大多將中藥中的某一特定有效成分提取出來，經生物轉化后，尋找新的化合物[3]，并通過藥理篩選來確定對新化合物的轉化是否有益。而中藥往往含有多種成分或組分，這種研究思路不適于一些靠復合成分起作用的中藥，也不利于將中藥中的一些無活性的前體轉化后形成活性成分，對中藥多成分或某一類組分的生物轉化研究能更真實反映中藥的作用機制[12]。

本研究以淫羊藿為研究對象，以植物乳桿菌為發酵菌株，考察淫羊藿發酵過程中1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和羥基自由基清除能力及多酚、黃酮、多糖含量的變化，采用UPLC-Q-TOF-MS法研究淫羊藿滅菌前后及發酵過程中主要活性成分的變化，以期在更深層次上闡明生物轉化在中藥發揮藥效過程中的作用，為制定合理的生物轉化工藝和質量標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）GIM1.191：廣東省微生物菌種保藏中心；淫羊藿（Epimedium brevicornuMaxim.）（批號：20211024）：洛陽醫藥城。

1.1.2 試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海思域化工科技有限公司；蘆丁、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、去水淫羊藿素、8-異戊烯基山柰酚標準品（純度均＞98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

X500R液質聯用儀（配有sciex os數據處理軟件和質譜自動校準調諧系統（calibrant delivery system，CDS））：美國AB sciex公司；PE Victor Nivo多功能酶標儀：帕金埃爾默企業管理有限公司；3-18KS高速冷凍離心機：德國Sigma公司；TDZ5-WS大容量離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JP300G超聲波提取、萃取機組：武漢嘉鵬電子有限公司；FMS超低溫超微粒粉碎機：臺灣弘荃機械企業有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；ALX-2000W 離心過濾器：北京金鼐科技發展有限公司；F-7000熒光分光光度計：日立科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵培養基的制備

將淫羊藿于60 ℃干燥箱中烘干至恒質量，用實驗室小型粉碎機粉碎過120目篩，按照料液比1∶8（g∶mL）添加體積分數70%的乙醇，置于超聲波提取裝置中超聲（超聲功率400 W，超聲頻率20 kHz，溫度40 ℃，轉速20 r/min）提取40 min后放入離心過濾器中過濾，離心（4 500 r/min、5 min），提取2次，合并2次濾液，將過濾后的濾液放入40 ℃恒溫水浴鍋中，蒸發至無醇味，按照1∶30（g∶mL）的比例添加蒸餾水稀釋作為發酵培養基，pH值自然，于121 ℃高壓滅菌15 min。

1.3.2 植物乳桿菌種子液的制備

將植物乳桿菌接入MRS固體培養基中，在34 ℃培養箱培養24 h，挑取單菌落在固體培養基上劃線，連續活化2次后，挑取單菌落接種于MRS液體培養基，置于34 ℃培養箱培養18 h，使最終植物乳桿菌濃度為1×106CFU/mL，即為植物乳桿菌三代種子液。

1.3.3 淫羊藿發酵液的制備

以10%的比例接種植物乳桿菌種子液至滅菌后的發酵培養基，裝液量為200 mL/250 mL，在34 ℃培養箱靜置培養61 h，分別在滅菌前、滅菌后以及不同發酵時間點（7 h、13 h、24 h、37 h、47 h、61 h）進行取樣，取樣后將發酵液離心（5 000 r/min、5 min）取上清液。

1.3.4 分析方法

（1）理化指標的測定

總黃酮含量測定：參照呂亭亭等[13]的方法，在波長510 nm處用酶標儀分別測定不同濃度蘆丁標準品的吸光度值，以蘆丁質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制蘆丁標準工作曲線，獲得蘆丁標準曲線回歸方程為Y=0.131 6X+0.002 4（相關系數R2=0.999），根據標準曲線回歸方程計算總黃酮含量。

總多酚含量的測定：參照王海坤等[14]的方法，于波長770 nm處測定沒食子酸吸光度值，以沒食子酸質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準工作曲線，獲得沒食子酸標準曲線回歸方程為Y=0.130 9X+0.075 4（相關系數R2=0.998 9），根據標準曲線回歸方程計算多酚含量。

多糖含量的測定：參照牛曉方等[15]的方法，在波長490nm處測定葡萄糖吸光度值，以葡萄糖質量濃度（X）為橫坐標，以吸光度值（Y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準工作曲線，獲得葡萄糖標準曲線回歸方程為Y=8.161X+0.024（相關系數R2=0.977），根據標準曲線回歸方程計算多糖含量。

（2）抗氧化性能的測定

DPPH自由基清除率參照張巖松等[16]的方法進行測定，其計算公式如下：

式中：A0為空白組吸光度值；A為樣品組吸光度值。

羥基自由基清除率參照白建華等[17]的方法進行測定，其計算公式如下：

式中：A0為空白組（緩沖液替代樣品）吸光度值；Ax為樣品組吸光度值；Ax0為樣品對照組（緩沖液替代H2O2溶液）吸光度值。

1.3.5 淫羊藿活性成分的質譜條件

淫羊藿活性成分的檢測采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法進行分析鑒定。

超高效液相色譜條件：Agilent eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為0.01%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B；3～63 min，5%～95%B；63～68 min，95%B；68～69 min，95%～5%B；69～73 min，5%B）；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量3 μL。

質譜條件：化合物掃描范圍m/z 50～1 500 Da；離子化溫度（temperature，TEM）：500 ℃；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；氣簾氣（curtain gas，CUR）：30 psi；去簇電壓（declustering potential，DP）：80 V；碰撞能量（collision energy，CE）：7 eV；正、負離子模式下噴霧電壓（ion spray voltage floating，ISVF）分別為5 500 V和-4 500 V。采用信息關聯采集；子離子掃描模式的參數設置如下：分子質量掃描范圍50～1 000 m/z，碰撞能量（CE）：（35±15）eV；其他主要參數同TOF-MS掃描模式，采用CDS對分子質量準確度進行自動校準。

1.3.6 淫羊藿化學成分的鑒定

查閱國內外淫羊藿及其同科屬植物化學成分研究相關文獻[18-22]，收集整理了淫羊藿中化學成分信息，建立包括化合物中文名、英文名稱、結構式、分子式、精確相對分子質量以及特征碎片的淫羊藿化學成分文獻信息。通過分析化學成分的質譜信息，利用SCIEX公司的Sciex os分析軟件，采用質量虧損過濾、中性丟失、產物離子過濾方法[23-25]提取色譜峰和對應的1級和2級質譜圖，與部分對照品和整理的化學成分文獻信息比對，根據準分子離子峰精確質量數，同位素峰，確定化合物分子式，然后結合軟件自帶譜庫、二級質譜碎片與對照品裂解規律進行比對或參照文獻，鑒定和推測出淫羊藿化學成分，利用Sciex os軟件對淫羊藿中化合物的峰面積進行積分，以色譜峰面積的大小來表示各化合物的相對含量。

1.3.7 數據處理

試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。采用SPSS26.0軟件進行顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 淫羊藿發酵過程中抗氧化活性的變化

自由基是生物生命活動中的重要物質，生物氧化代謝產生的氧自由基中以羥基自由基的氧化作用最強，它可通過電子轉移、奪取氫原子和羥基化反應攻擊脂質、蛋白質和核酸等生物分子造成機體損傷，活性成分對DPPH自由基和羥基自由基清除能力的強弱，能直觀反映其抗氧化活性的能力[26]。淫羊藿發酵過程中對DPPH自由基和羥基自由基清除率的變化見圖1。

圖1 淫羊藿發酵過程中DPPH自由基（A）和羥基自由基（B）清除率的變化Fig.1 Changes of DPPH radical (A) and hydroxyl radical (B)scavenging rates during Epimedium fermentation process

由圖1A和圖1B可知，隨著發酵的進行，在0～37 h內，DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率均呈現增加的趨勢；當發酵時間為37 h時，DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率均達到最大值，分別為29.59%、46.33%；發酵進行37 h后，兩者均呈緩慢下降的趨勢。

2.2 淫羊藿發酵過程中總黃酮、多酚、多糖含量的變化

淫羊藿發酵過程中對總黃酮、多酚、多糖含量的變化見圖2。

由圖2A可知，在發酵0～13 h，總黃酮含量呈快速增加的趨勢；當發酵時間＞13 h時，總黃酮含量整體呈現下降后增加的趨勢；當發酵時間為37 h時，總黃酮含量達到最大值，為11.90 mg/L；發酵時間＞37 h后，總黃酮含量變化趨于平緩。由圖2B可知，在發酵0～13 h，多酚含量呈快速增加的趨勢；當發酵時間＞13 h時，多酚含量整體呈先增加后下降的趨勢，當發酵時間為24 h時，多酚含量達到最大值，為1.56 mg/L；發酵時間＞24 h后，多酚含量變化趨于平緩。由圖2C可知，在發酵0～13 h，多糖含量呈快速增加的趨勢；當發酵時間＞13 h時，多糖含量整體呈先增加后下降的趨勢，當發酵時間為24 h時，多糖含量達到最大值，為0.18 g/L；當發酵時間＞37 h時，多糖含量逐漸下降。結合發酵過程中DPPH自由基和羥自由基清除率的變化（圖1）可知，植物乳桿菌對淫羊藿的發酵時間控制為37 h為宜，此時DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總黃酮、多酚、多糖含量分別為29.59%、46.33%、11.90 mg/L、1.51 mg/L、0.18 g/L。發酵過程中，多糖、多酚、黃酮含量和自由基清除率的變化具有明顯相關性，這和楊娟等[27]的實驗結果類似，植物乳桿菌利用淫羊藿作為發酵的藥性基質，植物乳桿菌能產生淀粉酶，葡萄糖苷酶等豐富的酶系，能有效破除植物類中藥細胞壁和果膠類物質形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，且可以打斷β糖苷鍵，將淫羊藿中含有的大量多糖苷轉化為相應的低糖苷或苷元，將酚酸轉化為小分子物質[9]，從而引起總黃酮和總多酚含量的升高，多糖含量的升高可能更多的來源于植物乳桿菌對淫羊藿糖苷類物質的分解，轉化為胞外多糖或自身多糖貯存[10]。在發酵后期，多糖、多酚、黃酮等物質的含量下降，其原因可能是，其營養物質消耗殆盡，植物乳桿菌更將多糖、多酚、黃酮作為能源物質消耗[28]。

圖2 淫羊藿發酵過程中總黃酮（A）、多酚（B）、多糖（C）含量的影響Fig.2 Changes of total flavonoids(A),polyphenols(B) and polysaccharides(C) during Epimedium fermentation process

2.3 淫羊藿活性成分的UPLC/Q-TOF/MS分析結果

淫羊藿化合物的UPLC/Q-TOF/MS分析結果見表1。由表1可知，利用UPLC-Q-TOF-MS共鑒定滅菌前、滅菌后及發酵13 h、37 h、61 h淫羊藿發酵液中含有57種化合物，其中，黃酮類成分51種，酚酸類成分4種，其他成分2種。黃酮類物質主要以黃酮苷的形式存在，其中，以去水淫羊藿素（以A表示）為苷元的成分有26種，以8-異戊烯基山奈酚（以B表示）為苷元的成分有10種，其他黃酮類成分15種，主要特征活性成分為以去水淫羊藿素（別名anhydroicaritin或8-異戊烯基山奈素）、8-異戊烯基山奈酚為苷元的具異戊烯基取代的黃酮，4種苷元結構如下所示。糖基取代發生在C-3位或C-7位，以多糖苷、二糖苷、單糖苷以及部分醛酸的形式存在[20-23]。

表1 淫羊藿黃酮苷類化合物的UPLC-Q-TOF-MS分析結果Table 1 Results of Epimedium flavonoid glycosides compound analyzed by UPLC-Q-TOF-MS

續表

續表

2.3.1 淫羊藿發酵過程中黃酮成分的變化

由表1可知，與滅菌后相比，植物乳桿菌發酵淫羊藿后，多糖苷中山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、淫羊藿新苷E、diphylloside B、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、去水淫羊藿素-3-O-吡喃鼠李糖基-葡萄糖醛酸-7-O-葡萄糖苷、寶藿苷Ⅵ、8-異戊烯基山奈酚-7-O-吡喃葡萄糖基-3-O-乙酰基吡喃鼠李糖基-木糖苷、1,3-異戊二烯基朝藿定A、1,3-異戊二烯基朝藿定C、1,3-異戊二烯基箭藿苷B-7-O-葡萄糖醛酸、朝藿苷丙、淫羊藿素-3-O-[（4-乙酰氧基）鼠李糖-2-O-（2-乙酰氧基）葡萄糖]-7-O-葡萄糖苷或其同分異構體發酵61 h后相對含量降低，其中朝藿定A1、朝藿定A、1,3-異戊二烯基箭藿苷B-7-O-葡萄糖醛酸、朝藿苷丙發酵后相對含量顯著降低（P＜0.05）。二葉淫羊藿苷B發酵61 h后無明顯變化。

與滅菌后相比，雙糖苷中，槲皮素-3,7-O-二鼠李糖苷、山柰苷、朝藿定E、淫羊藿新苷A、箭藿苷C、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、大花淫羊藿苷F、箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷II的異構體、淫羊藿素-3-O-呋喃鼠李糖苷及其異構體、淫羊藿素-3-O-（4-乙酰氧基）木糖-7-O-（3-乙酰氧基）葡萄糖苷、1,3-異戊二烯基箭藿苷A發酵61 h后相對含量降低，其中淫羊藿新苷A、箭藿苷C、大花淫羊藿苷F、箭藿苷A、箭藿苷B、淫羊藿素-3-O-呋喃鼠李糖苷及其異構體、淫羊藿素-3-O-（4-乙酰氧基）木糖-7-O-（3-乙酰氧基）葡萄糖苷、1,3-異戊二烯基箭藿苷A相對含量顯著降低（P＜0.05）；寶藿苷VII先降低再升高，去水淫羊藿素-3-O-吡喃鼠李糖基-呋喃酸或其異構體先升高再降低，但未達到顯著水平（P＞0.05）；去甲基箭藿苷A、去水淫羊藿素-3,7-二-O-葡萄糖苷發酵后相對含量顯著升高（P＜0.05），淫羊藿苷無明顯變化。

單糖苷中，淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅱ發酵后先增加后減少，其最大值出現在發酵37 h，且最大值和滅菌后相對含量相比均具有顯著性差異（P＜0.05）；紫云英苷、槲皮苷發酵后含量先增加后降低，且最低值和滅菌前相比有顯著差異（P＜0.05）。在淫羊藿黃酮苷元中，去水淫羊藿素隨發酵時間增加而增加，8-異戊烯基山奈酚、大黃素、槲皮素、山奈酚、木犀草素發酵過程中先增加后減少，8-異戊烯基山奈酚、大黃素最大值出現在發酵37 h，槲皮素、山奈酚、木犀草素最大值出現在發酵后13 h，木犀草素最大值和發酵前相對含量相比有顯著差異（P＜0.05）。

總體上來看，植物乳酸菌對淫羊藿的發酵呈現多糖苷、雙糖苷向單糖苷和苷元轉化的規律。低糖苷和苷元從化學結構上增加了活性的OH級，減少了空間位阻，具有更大的抗氧化活性，這和國內外多位學者的研究是相符的[29]，本次研究DPPH自由基、羥基自由基清除率的增加以及總黃酮含量的提高也再一次印證了這個結果。

2.3.2 高溫滅菌對淫羊藿黃酮成分的影響

由表1可知，滅菌后，次糖苷淫羊藿苷和寶藿苷I相對含量升高；多糖苷中，朝藿定A、淫羊藿素-3-O-[（4-乙酰氧基）鼠李糖-2-O-（2-乙酰氧基）葡萄糖]-7-O-葡萄糖苷等多糖苷的相對含量降低，但是大部分多糖苷，如朝藿定A1、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅵ、1,3-異戊二烯基朝藿定等的相對含量不僅沒有降低而且較高溫滅菌前均有所升高。孫娥等[30]的研究表明，將淫羊藿油炙（油炙溫度160～170 ℃，受熱時間5～7 min）可以使淫羊藿黃酮脫去糖基，由多糖苷轉化為次糖苷（多糖苷朝藿定A、B、C含量降低，淫羊藿苷、寶藿苷I的含量增高），這可能和實驗中采用的溶劑、溫度、濕度、壓力等條件不同所致。

另外，淫羊藿3種酚酸中，綠原酸、對羥基肉桂酸、3-O-對香豆酰基奎寧酸高溫滅菌后含量也顯著升高。滅菌的高溫高壓條件下淫羊藿糖苷類成分可能同時發生兩種變化，一種是高溫、高壓條件下的化學變化，多糖苷和低糖苷水解，分別轉化為低糖苷或苷元，另外一種是滅菌的高溫高壓的物理作用和酶的“破壁作用”，破壞了植物類中藥細胞壁和果膠類物質形成的物理屏障，使得活性成分溶出增加所致[31]，這從滅菌后多糖、黃酮、多酚含量和羥基自由基、DPPH自由基清除率增加的實驗結果中也得到了驗證。

3 結論

淫羊藿經乳酸菌發酵后，DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、總黃酮、多酚、多糖含量均顯著提高，發酵后的淫羊藿具有更高的抗氧化功效，最適的發酵時間為厭氧發酵37 h。從淫羊藿經植物乳桿菌發酵前后組分共鑒定出57種，其中，黃酮類51種，酚酸類4種、其他類2種。植物乳桿菌以淫羊藿作為藥性基質進行生物轉化總體上顯著提高了酚酸類、黃酮單糖苷和黃酮苷元的含量，降低了淫羊藿黃酮多級糖苷和二級糖苷的含量。單糖苷和苷元含量的提高可能來自于黃酮多糖苷和二糖苷的生物轉化，植物乳酸菌利用淫羊藿中的營養成分和轉化糖苷后的糖類作為自身生長的物質基礎，多糖含量有了明顯提高，多糖和酚酸含量的提高可能分別來自于植物乳桿菌的合成代謝和對植物細胞的破壁作用。