枸杞南瓜粉的制備、體外消化特性和抗氧化活性的研究

孫敢超，方海田，劉宗儒，劉 娜，曹青青，張兆鑫

（寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarum）是重要的藥食兩用植物資源[1]，研究表明，枸杞具有保肝[2]、明目[3]、抗癌[4]、抗抑郁[5]、調(diào)節(jié)免疫[6]等藥理作用。南瓜具有良好的栽培特性[7]，營養(yǎng)豐富，含有人體所需的多糖、類胡蘿卜素等多種天然活性物質(zhì)[8]，具有降血糖、降脂保肝、抗氧化等多種藥用價值[9]。

益生菌是一類具有維持腸道菌群平衡，增強免疫力功效的活性微生物，相比單菌發(fā)酵而言，復(fù)合益生菌發(fā)酵更能賦予果蔬汁獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)功能[10]；且經(jīng)過噴霧干燥制備的果蔬粉具有良好的分散性和溶解性，可保持果蔬原有營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味，使儲存和運輸更加方便[11]。如張璐等[12]通過對比單一及混合益生菌發(fā)酵獼猴桃果汁，發(fā)現(xiàn)混合益生菌發(fā)酵獼猴桃果汁香氣更濃郁，更適合生產(chǎn)；張振民等[11]通過對比脫脂乳粉及β-麥芽糊精協(xié)同減壓噴霧干燥技術(shù)制備棗粉，發(fā)現(xiàn)選擇以脫脂乳粉作為助干劑和保護劑，其產(chǎn)品助干效果和保護效果均顯著優(yōu)于β-麥芽糊精。

但是目前市面上枸杞南瓜深加工制品相對較少，且南瓜多數(shù)仍以鮮食為主，其加工產(chǎn)業(yè)附加值較低；因此實驗采用同樣具有抗氧化、保肝、促進腸道健康等功能的枸杞南瓜結(jié)合乳酸菌進行發(fā)酵制備成粉作為研究方向，一方面可以促進枸杞、南瓜的深加工進一步發(fā)展、減少因地域和季節(jié)造成的資源浪費；另一方面益生菌又能與枸杞、南瓜起到協(xié)同作用，從而提高產(chǎn)品的抗氧化能力及促進腸道健康的能力。

本研究以枸杞、南瓜為原料，利用植物乳桿菌（Lactobacillu plantarum）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）混菌（5∶1）發(fā)酵枸杞南瓜汁，以噴霧干燥法制備枸杞南瓜粉，采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化噴霧干燥工藝，并通過體外模擬胃腸消化試驗及自由基清除試驗研究枸杞南瓜粉的消化特性及氧化活性，旨在進一步推進果蔬汁益生菌發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展并為果蔬粉新產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞、板栗南瓜、小蘇打、白砂糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillu plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）：寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室；D-異抗壞血酸鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉（編號為190-12865）：日本和光純藥工業(yè)公司；胃蛋白酶（酶活30 000 U/g）、胰蛋白酶（酶活250 U/mg）、豬膽鹽：博奧拓達科技有限公司；果膠酶（酶活500 U/mg）、1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）diammonium salt，ABTS）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JYK-C051 榨汁機：中國杭州九陽小家電有限公司；PB-LO pH 計：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；B-290小型噴霧干燥儀：步琦實驗室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞南瓜粉的制備

枸杞汁的制備：枸杞干果去除表面污垢后，以水料比5∶1（mL∶g）先加水浸泡8～9 h，再加入0.05%的D-異抗壞血酸鈉作為護色劑打漿，加入總體積0.15%的果膠酶，于50 ℃條件下水浴2h。用濾布過濾后，用小蘇打調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.5之間，在80 ℃條件下殺菌15 min，冷卻后得到枸杞汁，備用。

南瓜汁的制備：將南瓜剝皮去芯，以水料比4∶1（mL∶g）加水，再加入0.05%的D-異抗壞血酸鈉作為護色劑打漿，加入總體積0.15%的果膠酶，于50 ℃條件下水浴2 h，后用小蘇打?qū)㈣坭街膒H值調(diào)至6.0～6.5之間，在80 ℃條件下殺菌15 min，冷卻后得到南瓜汁，備用。

枸杞南瓜粉的制備[14]：在滅菌后的枸杞南瓜汁中（體積比為5∶1）接種4%的混菌，其中植物乳桿菌（Lactobacillu plantarum）與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）體積比為5∶1，并于37 ℃條件下厭氧發(fā)酵15 h，當(dāng)pH達到4.0～4.2之間時判定發(fā)酵結(jié)束，加入3%白砂糖，得到發(fā)酵枸杞南瓜原漿，對其進行噴霧干燥，得到枸杞南瓜粉。

1.3.2 噴霧干燥工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗[13]

以進口熱風(fēng)溫度（140 ℃、150 ℃、160 ℃、170 ℃、180 ℃）、進料流量（6.0 mL/min、7.5 mL/min、9.0 mL/min、10.5 mL/min、12.0 mL/min）、脫脂乳粉添加量（0、2%、3%、4%、5%）作為自變量，以感官評分與集粉率作為評價指標(biāo)，考察上述各因素對噴霧干燥的影響。

（2）響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以進口熱風(fēng)溫度（A）、進料流量（B）和脫脂乳粉添加量（C）為自變量，以集粉率（Y1）和感官評分（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平Box-Behnken試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 體外模擬胃腸消化試驗

參考文獻[15]略有改動，稱取未發(fā)酵枸杞南瓜粉10 g作為對照組、發(fā)酵枸杞南瓜粉10 g作為發(fā)酵組分別做體外模擬試驗，置于400 mL生理鹽水混合均勻，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，加入5 mL模擬胃液（0.2 g胃蛋白酶溶入5 mL 0.01 mol/L HCl溶液）充分溶解，置于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩器中振蕩2 h，每隔0.5 h取樣一次，每次取樣10 mL；體外模擬胃消化結(jié)束后向胃消化液中用1 mol/L碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入5 mL腸液（0.2 g胰蛋白酶和1.24 g豬膽鹽溶于50 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液），混合均勻，置于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩器振蕩4 h，每隔1 h取樣一次，每次取樣10 mL。胃腸消化階段取得的樣品于12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，離心后樣品在-80 ℃保存，每次使用前溶解。

1.3.4 分析檢測

（1）活菌數(shù)測定

參考文獻[16]，采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定。

（2）感官評價

邀請12名感官評價培訓(xùn)合格的同學(xué)組成感官評價小組對發(fā)酵后的枸杞南瓜粉進行無記名打分。首先對成粉的色澤、組織狀態(tài)進行評價，然后取3 g枸杞南瓜粉溶于50 mL溫開水進行氣味、口感及整體協(xié)調(diào)性評價，滿分為100分，取平均值作為最終感官評分。

表2 枸杞南瓜粉感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of L.barbarum pumpkin powder

（3）集粉率測定

參考文獻[17]略有改動，集粉率反映了不同干燥條件對枸杞南瓜粉干燥效果的影響，其計算公式如下：

式中：M1為收集到噴霧干燥枸杞南瓜粉質(zhì)量，g；M2為枸杞南瓜發(fā)酵原漿固形物含量，g；M3為脫脂乳添加量，g。

（4）總多酚、總黃酮含量的測定

采用福林酚法測定總多酚含量[18]，以沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示樣品中總多酚含量，以μgGAE/mL表示；采用硝酸鋁顯色法測總黃酮含量[19]，蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）表示樣品中總黃酮含量，以μgRE/mL表示。

（5）抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率的測定參考ARISE A K等[20]的方法；羥自由基清除率的測定參考何坤明等[21]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)處理3次，應(yīng)用Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken試驗設(shè)計繪圖、SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1a可知，隨著進口熱風(fēng)溫度的升高，集粉率和感官評分整體呈先上升再下降趨勢；當(dāng)進口熱風(fēng)溫度＜160 ℃時，由于受熱不均勻，導(dǎo)致物料干燥不充分，集粉率與感官評價較低；當(dāng)進口熱風(fēng)溫度為160 ℃時，集粉率與感官評價最高，分別為41.57%、89.33分；當(dāng)進口熱風(fēng)溫度＞160 ℃之后，高溫使物料中的糖類物質(zhì)發(fā)生焦糖化反應(yīng)以及溶化反應(yīng)，出現(xiàn)粘壁現(xiàn)象，口感和集粉率降低[22]。因此，進口熱風(fēng)溫度在160 ℃為宜。

圖1 各單因素對枸杞南瓜粉集粉率及感官評分的影響Fig.1 Effect of various factors on the powder collection rate and sensory score of L.barbarum pumpkin powder

由圖1b可知，當(dāng)進料流量＜7.5 mL/min時，由于進料量較小，料液受熱較為充分，枸杞南瓜汁的干燥效果較好，但缺點是其耗時較長；當(dāng)進料流量為7.5 mL/min時，集粉率與感官評價最高，分別為43.64%、90.00分；當(dāng)進料流量＞7.5 mL/min之后，由于進料速度加快，物料受熱不充分，導(dǎo)致產(chǎn)品中含水量愈來愈高，集粉率和口感下降，嚴(yán)重會出現(xiàn)滴液現(xiàn)象。因此，進料流量選擇7.5 mL/min為宜。

由圖1c可知，當(dāng)脫脂乳粉添加量0～2%時，隨著脫脂乳粉的添加，使物料中可溶性固形物含量增加，便于干燥，同時賦予產(chǎn)品一股淡淡的奶香味；當(dāng)脫脂乳粉添加量2%時，集粉率最高，為42.72%，感官評分為86.33分；當(dāng)脫脂乳粉添加量＞2%之后，物料中固形物含量增大，影響噴霧效果，嚴(yán)重時會阻塞干燥噴頭。因此，脫脂乳粉添加量選擇2%為宜。

綜上所述，噴霧干燥單因素優(yōu)化參數(shù)為進口熱風(fēng)溫度160 ℃，進料流量7.5 mL/min，脫脂乳粉添加量2%。

2.1.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以進口熱風(fēng)溫度（A）、進料流量（B）和脫脂乳粉添加量（C）為自變量，以集粉率（Y1）和感官評分（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平Box-Behnken試驗，響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析見表3，方差分析結(jié)果見表4，得到的二次多項回歸方程分別為：

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，集粉率Y1和感官評價Y2的回歸方程的F值分別為49.70、17.58，P值均＜0.01，表明模型均極顯著，Y1、Y2模型失擬項F值分別為0.16、1.32，P值分別為0.915 2、0.383 7（P值均＞0.05），失擬項均不顯著，說明方程的擬合度較好，可以用兩個模型對試驗響應(yīng)值進行分析和預(yù)測。決定系數(shù)R2分別為0.984 6、0.957 6，校正決定系數(shù)R2adj分別為0.964 8、0.903 1；變異系數(shù)分別為3.10%、1.67%。由P值可知，一次項中脫脂乳粉添加量（C）對集粉率（Y1）和感官評價（Y2）影響極顯著（P＜0.01），進料流量（B）對集粉率影響極顯著（P＜0.01），對感官評價影響顯著（P＜0.05），進口熱風(fēng)溫度（A）對集粉率影響極顯著（P＜0.01），對感官評價影響不顯著（P＞0.05）；二次項中A2、B2對集粉率和感官評價影響極顯著（P＜0.01），C2對集粉率影響不顯著（P＜0.05），對感官評價影響極顯著（P＜0.01）；交互項中AC對集粉率影響顯著（P＜0.05），對感官評價影響顯著（P＜0.05），AB、BC對集粉率影響不顯著（P＞0.05），對感官評價影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，各因素對噴霧干燥后集粉率影響大小為進口熱風(fēng)溫度（A）＞脫脂乳粉添加量（C）＞進料流量（B）；各因素對感官評價的影響大小為脫脂乳粉添加量（C）＞進料流量（B）＞進口熱風(fēng)溫度（A）。

響應(yīng)面等高線形狀以及曲線坡度可以反映出影響響應(yīng)值結(jié)果各因素之間的相互作用，若兩因素交互作用不顯著，等高線性狀呈圓形；兩因素交互作用顯著，等高線性狀呈橢圓形。

由圖2a、2b、2c可知，脫脂乳粉添加量與進料流量、進口熱風(fēng)溫度的響應(yīng)面坡度較陡，等高線性狀趨向于橢圓形，說明脫脂乳粉添加量與進料流量、進口熱風(fēng)溫度對噴霧干燥后集粉率交互作用顯著，同理可得，進口熱風(fēng)溫度與進料流量對集粉率的交互影響最小；由圖2d、2e、2f可知，進口熱風(fēng)溫度與進料流量、進料流量與脫脂乳粉添加量、進口熱風(fēng)溫度與脫脂乳粉添加量三者響應(yīng)面坡度陡，交互作用等高線均趨于橢圓形，說明三者交互作用顯著，對感官評價的影響較大。

圖2 各因素交互作用對枸杞南瓜粉集粉率及感官評分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction of factors on powder collection rate and sensory score of L.barbarum pumpkin powder

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面分析后得到的最佳噴霧干燥工藝為：進口熱風(fēng)溫度159.9℃，進料流量7.32mL/min，脫脂乳粉添加量2.5%，在該條件下得到的集粉率預(yù)測值為40.8%，感官評分預(yù)測值為88.8分。為了便于實際操作，將最佳噴霧干燥工藝修正為：進口熱風(fēng)溫度160 ℃，進料流量7.5 mL/min，脫脂乳粉添加量2.5%。在此優(yōu)化條件下，進行3次平行驗證試驗，集粉率實際值為40.3%，感官評分實際值為89.3分，與集粉率和感官評分預(yù)測值相近，說明方程擬合度良好，模型可靠。

2.2 體外模擬胃腸消化試驗

2.2.1 總黃酮、總多酚變化

枸杞南瓜粉在體外模擬胃腸消化過程中總黃酮及總多酚含量的變化結(jié)果見圖3。

由圖3A可知，在體外模擬胃腸消化實驗中，對照組和發(fā)酵組胃腸消化階段的總黃酮含量隨消化時間增加不斷降低。在胃消化2 h后，發(fā)酵組總黃酮含量為對照組的1.89倍，這可能是發(fā)酵組在發(fā)酵時的酸性環(huán)境中釋放了部分黃酮類物質(zhì)，而對照組未經(jīng)發(fā)酵，導(dǎo)致對照組中的樣品在酸性環(huán)境和胃蛋白酶的雙重作用下極大地促進了黃酮類物質(zhì)的釋放[18]。在腸消化階段，總黃酮含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，且整體高于胃消化組，腸消化2 h后發(fā)酵組總黃酮含量為對照組的1.54倍。這可能是由于pH突然升高使原來在酸性環(huán)境下沉淀的大分子物質(zhì)再次溶解[23]，而后在胰液和膽汁的作用下使黃酮類物質(zhì)的降解量大于釋放量有關(guān)[24]。消化結(jié)束后，對照組總黃酮含量較胃消化0 h下降了14.81%，發(fā)酵組總黃酮含量下降了6.35%。

由圖3B可知，胃腸消化過程中總多酚的變化規(guī)律與總黃酮相似，但總體下降趨勢較快，這說明在胃消化階段黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性優(yōu)于多酚類物質(zhì)。胃消化2 h后，由于酸性環(huán)境對于酚類物質(zhì)的穩(wěn)定具有一定作用，使得發(fā)酵組的總多酚含量為對照組的1.27倍。在腸消化2 h后，由于胰酶和膽汁作用，使蛋白質(zhì)與多酚之間的共價鍵斷裂，釋放出更多的自由酚類物質(zhì)，消化后期酚類物質(zhì)出現(xiàn)不穩(wěn)定降解，發(fā)酵組總多酚含量為對照組的1.23倍[25]。消化結(jié)束后，對照組總多酚含量較胃消化0 h下降了3.01%，發(fā)酵組總多酚含量上升了2.21%。胃腸消化過程中總黃酮含量的變化規(guī)律與總多酚類似，但總黃酮含量變化幅度較小，這說明黃酮類物質(zhì)在模擬胃腸液中較穩(wěn)定。

圖3 枸杞南瓜粉在體外模擬胃腸消化過程中總黃酮（A）及總多酚（B）含量的變化Fig.3 Changes of total flavones(A)and total polyphenols(B)contents in L.barbarum pumpkin powder during simulated gastrointestinal digestion in vitro

2.2.2 抗氧化活性變化

枸杞南瓜粉在體外模擬胃腸消化過程中抗氧化活性的變化結(jié)果見圖4。由圖4可知，在體外模擬胃腸消化實驗中抗氧化活性在消化0.5 h出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。在胃消化階段，0.5 h后自由基清除率出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），隨后逐漸穩(wěn)定，胃消化結(jié)束后對照組ABTS+、DPPH、羥自由基清除率分別下降了9.09%、7.48%、6.17%，發(fā)酵組ABTS+·、DPPH·、羥自由基清除率分別下降了8.99%、3.45%、2.18%；發(fā)酵組抗氧化活性物質(zhì)含量變化分別是對照組的1.27倍、1.17倍和1.12倍。這可能是由于酸性環(huán)境有利于抗氧化物質(zhì)釋放，也有可能是在酸性條件下多酚類和黃酮類物質(zhì)發(fā)生不同程度的水解，與實驗組的抗氧化物質(zhì)變化呈現(xiàn)相關(guān)性。

圖4 枸杞南瓜粉在體外模擬胃腸消化過程中抗氧化活性的變化Fig.4 Changes of antioxidant activities of L.barbarum pumpkin powder during simulated gastrointestinal digestion in vitro

腸消化2 h后，發(fā)酵組抗氧化活性物質(zhì)含量變化分別是對照組的1.25倍、1.14倍和1.13倍；腸消化4 h后，對照組ABTS+、DPPH、羥自由基清除率分別下降了4.18%、5.04%、7.59%，發(fā)酵組ABTS+、DPPH、羥自由基清除率分別下降了2.09%、2.92%、3.45%；變化趨勢與總多酚、總黃酮含量變化相似，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且腸消化階段抗氧化物質(zhì)的清除率明顯高于胃消化階段，這說明抗氧化活性物質(zhì)的清除率與總多酚、總黃酮含量呈現(xiàn)正相關(guān)。

在整個消化階段，ABTS+·清除率對照組、發(fā)酵組分別上升了0.14%、2.96%；DPPH·清除率對照組下降了0.72%、發(fā)酵組上升了1.73%；羥自由基清除率對照組下降了4.61%、發(fā)酵組上升了4.74%，綜上表明枸杞南瓜粉發(fā)酵組的生物利用率高于對照組。

3 結(jié)論

單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化噴霧干燥工藝為進口熱風(fēng)溫度160 ℃，進料流量7.5 mL/min，脫脂乳粉添加量2.5%；此時所得枸杞南瓜粉集粉率達40.3%，感官評分89.3分。通過對最佳工藝條件下的枸杞南瓜粉的體外模擬胃腸消化研究分析發(fā)現(xiàn)，消化結(jié)束后測得發(fā)酵組消化液中總多酚、總黃酮含量分別上升了2.21%、6.35%，ABTS+·、DPPH·、羥自由基清除率分別為58.26%、86.43%、70.98%，顯著高于對照組（P＜0.05），且腸消化階段的抗氧化能力顯著高于胃消化階段（P＜0.05）。這表明發(fā)酵枸杞南瓜粉在酶和膽汁的作用下總多酚、總黃酮得到充分釋放、整體抗氧化能力得到提高，有利于調(diào)節(jié)人體胃腸道消化進程、增大對樣品大分子物質(zhì)的生物利用率。