農藥殘留對普洱茶發酵中揮發性香氣物質的影響

單治國，黃紅平，滿紅平，顏學行，趙 媛，周紅杰，張乃明，張春花*

（1.普洱學院 農林學院，云南 普洱 665000；2.云南農業大學 茶學院，云南 昆明 650201；3.國家普洱茶產品質量監督檢驗中心，云南 普洱 665000）

隨著農業的發展和人們對食品安全問題的日益重視[1]，普洱茶中農藥殘留問題越來越受到消費者的高度關注，也成為我國普洱茶安全涉及的首要問題之一。茶樹在生長過程中，直接噴灑農藥，在采摘、萎凋、殺青、干燥、發酵、蒸壓、存貯、運輸等過程中環境污染也可能會導致茶葉中殘留農藥，甚至可能超標[2]。目前，茶葉中的農藥殘留是影響我國茶葉出口的主要技術性貿易壁壘[3]。普洱茶以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志保護范圍內采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質特征。普洱茶分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）兩大類[4]。在普洱茶原料的栽培區域，由于夏秋季節多雨、高濕、高溫，常導致真菌病害的頻繁發生。因此，使用農藥預防和防治病害的侵染、爆發成了茶區普遍采用的方法。由于茶園田間管理不規范，一些殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等農藥存在過量施用的情況，導致部分茶葉產品中農藥殘留量超標，給中國茶葉的質量安全帶來了巨大隱患，這一問題已經引起行業內廣泛重視[5]。開展了關于茶葉生產中的農殘問題的一系列研究，主要集中在栽培管理[6-8]、加工過程[9-11]、貯藏[12]等方面。

茶葉種植過程中，聯苯菊酯（bifenthrin）因其殺蟲譜廣、高效、低毒、藥效持久[13]、茶湯中浸出率低[14-16]、安全間隔期短等特點作為茶園常用的農藥之一。國家標準GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定聯苯菊酯的最大殘留量為5 mg/kg[17]，是允許有殘留的農藥之一[18]。如果聯苯菊酯被攝入體內，會有積累作用，是人體健康存在的風險之一[5]，因此，在保障普洱茶產量、品質的同時，在生產環節盡可能減少聯苯菊酯的使用量顯得尤為重要[19]。香氣和內含成分是評價普洱茶品質的重要指標，聯苯菊酯的使用會影響普洱茶的品質，決定著普洱茶的風味和典型性，直接影響消費者對普洱茶的感官評價和喜好。普洱茶中香氣物質的含量和種類對普洱茶的品質有重要影響，研究接種有益菌進行發酵對普洱茶香氣的影響，對于提高和改善普洱茶的質量有重要價值。近年來，國內外在茶葉中農藥殘留分析檢測方面做了大量工作，已經能準確分析近500多種農藥殘留（殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等）[20-25]。華建坤等[26]研究發現，普洱生茶農藥殘留量一般高于經過發酵處理后普洱熟茶中的農藥殘留量，這主要與普洱茶發酵過程中的微生物分解、高溫高濕水解等作用有關。研究表明，殘留的農藥和釀酒酵母菌會相互作用，農藥殘留物質會影響釀酒酵母菌等微生物的正常生長代謝[27-30]，抑制釀酒酵母的生長或延遲釀酒酵母的發酵[31]等，同時不利于含氮化合物和硫化物的轉化，影響其芳香物質的產生，甚至產生一些不良代謝產物和異味物質[32]；相應釀酒酵母菌能降解或吸附部分農藥殘留物[33]，雖然在發酵過程中，可以使部分農藥降解或轉化，但是也會有部分農藥和副產物殘留在茶葉中，從而影響其品質。

本研究以云南省普洱市主要大葉種曬青毛茶為原料，基于同時蒸餾萃取（simultaneousdistillationextraction，SDE）和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術，通過將人為噴灑聯苯菊酯后的曬青毛茶分別人工接種釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）及對照組（不接菌）進行固態發酵，將4種固態發酵過程中普洱茶揮發性香氣物質的變化進行比較分析，以期為普洱茶固態發酵工藝優化及其農藥殘留安全性標準的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

曬青毛茶：選自普洱市茶樹良種場種植的云南大葉種茶樹（Camellia sinensis（Linn.）var.assamica）上采摘的生態有機一芽三葉、四葉鮮葉加工而成的。

黑曲霉（Aspergillus niger）ZL200510010941.4、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZL 200510010940.X和產黃青霉（Penicillium chrysogenum）：云南農業大學自然科學基金項目研究組從普洱茶固態發酵過程中所分離、純化、鑒定、保存、篩選、擴繁而得的優勢益生菌。

1.1.2 化學試劑

聯苯菊酯標準品（純度為99.7%）：中國計量科學院化學所；2.5%聯苯菊酯乳油：蘇州富美實植物保護劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-14B型氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）：日本島津公司；HB-TSZL型同時蒸餾萃取（SDE）裝置：安徽長城玻璃儀器制造廠；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

2.5%聯苯菊酯經180倍稀釋處理后，取50 mL，加水9 L（用藥量按實際每重復噴施質量折算，按照曬青毛茶固態發酵潮水量為30%，即每30 kg曬青毛茶葉用水量9 L兌水均勾噴霧），用背負式手動噴霧器在準備用于固態發酵的曬青毛茶（30 kg）上，使其含有一定濃度的農藥，讓其自然堆放2 h后取樣，放置于室內自然晾干至茶樣含水量為10%，-30 ℃保存，用以測定香氣物質。

試驗設置4個處理方式：噴灑藥2 h并取樣后，分別接種釀酒酵母菌、黑曲霉、產黃青霉和不接菌種處理分別進行發酵。用小型噴霧器將三種有益菌種（釀酒酵母菌、黑曲霉、產黃青霉），按液茶比為1∶10（mL∶g）的比例均勻灑在曬青毛茶上進行普洱茶固態發酵（堆高60 cm，并壓實，在表面及四周蓋上濕布），每個處理設置3個重復，每個重復30 kg茶葉，人工控制發酵茶堆溫度40～60 ℃，相對濕度35%，發酵環境溫度25 ℃，環境相對濕度為90%，翻堆6次，分別于發酵后的7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翻堆，并按五點取樣法分別采集固態發酵的五個點（固態發酵中心點和距離中心點1 m處的4個點），合并為一個混合待測樣品，設3個重復，各1 kg，于室內自然晾干至含水量為10%，以測定芳香物質的量。

1.3.2 分析方法

（1）茶葉揮發性物質的提取

本試驗采用SDE法提取茶葉中揮發性香氣物質，將采集的發酵后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翻堆樣準確稱量100 g，裝入1 000 mL的蒸餾瓶中，加入500 mL煮沸的蒸餾水，搖勻后加入30 mL二氯甲烷提取3 h，常壓蒸餾至不再有揮發性物質餾出為止。將供試茶樣置于蒸餾萃取設備內，萃取液經分流除水濃縮至0.5 mL，用氣質聯用儀進行檢測。

（2）揮發性成分的GC-MS分析條件

氣相色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣（He）；進樣口溫度260 ℃；柱流速1.2 mL/min，進樣量1 μL；分流比20∶1；升溫程序：起始溫度40 ℃（保持2 min），以2 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升溫至210 ℃，保持10 min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子倍增器電壓1 894 V；電子能量70 eV；掃描范圍20～500 m/z。

（3）揮發性組分的定性和定量

利用美國國家標準與技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2.0-Wiley275質譜庫對得到的各色譜峰進行串連檢索，依據樣品中組分的質譜圖與GC-MS化學工作站標準物的標準圖譜的匹配度以及樣品中組分的保留時間與標準化合物在GC-MS上保留時間的匹配度，再參考相關文獻，對組分進行定性；采用面積歸一化法（各香氣組分的峰面積占總峰面積之比值）確定各揮發性化合物的相對含量。

1.3.3 數據分析

揮發性香氣物質中各物質的量用SPSS 24.0統計軟件進行分析，每個處理重復3次，每個測定重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 聯苯菊酯施藥前后曬青毛茶中揮發性物質的比較分析

聯苯菊酯藥前曬青毛茶中揮發性物質香氣成分及相對含量結果見表1。由表1可知，從聯苯菊酯藥前曬青毛茶中共檢測出46種揮發性化合物，所鑒定的成分約占揮發性物質色譜峰總峰面積的178.89%；從聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中共檢測出46種揮發物，所鑒定的成分約占揮發性物質色譜峰總峰面積的245.34%，藥后比藥前增加66.45%。

表1 聯苯菊酯藥前和藥后2 h茶葉揮發性成分種類和相對含量的變化Table 1 Changes of types and relative contents of volatile components in the tea before and after bifenthrin treatment 2 h

續表

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在聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中分別檢測鑒定出14種新產生的獨有的揮發性物質（苯乙醇、3,7,11-三甲基-1-十二烷醇、1-乙基十六醇、三十七醇、1-乙基十六醇、異硬脂酸甲酯、N-芐氧羰基-L-精氨酸、十三烷等）；且有14種（1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、2-氨基-1,3-丙二醇、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-戊二醇、苯乙酮、水楊酸甲酯、乙酸異丁酯、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷、N-乙基琥珀酰亞胺、1,5,5-三甲基-6-亞甲基環已烯、二十烯酸等）揮發性物質未檢測出；共有組分有32種（芳樟醇、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ）、α-松油醇、香葉醇、（E）-香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、7,9-二叔丁基-1-氧雜螺（4,5）癸烯二酮、D-檸檬烯（苧烯）、1-石竹烯等）。聯苯菊酯藥后產生的揮發物在種類和數量上都有很大的變化，揮發物的種類變化（藥前曬青毛茶中存在的14種香氣物質在藥后2 h未被檢測到，并且產生14種新的香氣物質）、含量上升（178.89%上升至244.25%），各組分占所有檢測到的物質的比例也發生變化，并且對于同一種化合物二者（藥前和藥后2 h曬青毛茶）在含量上也存在很大差異，有增有減，各揮發物組分在施用農藥后相對含量的變化情況不同，這可能是由于其合成途徑的差異造成的。聯苯菊酯藥前曬青毛茶相對含量最大的是葉綠醇（29.85%）、芳樟醇（15.29%）、7,9-二叔丁基-1-氧雜螺（4,5）癸烯二酮（13.59%）、α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇（13.11%）、水楊酸甲酯（10.12%）、2,6,10-三甲基十四烷（10.88%），其次是beta-紫羅蘭酮（8.88%）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）（7.74%）、1-石竹烯（7.54%）、香葉醇（6.25%）、2-氨基-1,3-丙二醇（5.99%）、月桂酸異辛酯（5.06%），相對較高的有順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇（4.96%）、α-松油醇（3.81%）、1,3-二甲基萘（3.76%）、2,7-二甲基萘（3.73%）、D-檸檬烯（苧烯）（1.66%）等。

聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶相對含量最大的是芳樟醇（25.52%）、葉綠醇（21.31%）、棕櫚酸甲酯（12.39%）、α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇（10.62%）、2,7-二甲基萘（10.13%）、α-松油醇（10.06%）、2,6,10-三甲基十四烷（10.88%），其次是β-紫羅蘭酮（9.98%）、1,3-二甲基萘（9.71%）、1-甲基萘（9.19%）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ）（9.30%）、（Z,Z,Z）-亞麻酸甲酯（8.07%）、月桂酸異辛酯（8.55%）、2-甲基萘（7.33%）、1-石竹烯（6.87%）、十三烷（6.18%）、香葉醇（6.25%）、亞油酸甲酯（5.66%），相對較高的有順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇（4.61%）、4-氨基-3-甲基苯酚（4.37%）、4,6-二叔丁基間甲酚（4.09%）、D-檸檬烯（苧烯）（1.81%）、水楊酸甲酯（2.78%）、（E）-香葉基丙酮（2.81%）、7,9-二叔丁基-1-氧雜螺（4,5）癸烯二酮（1.94%）等。由此可見，藥前、藥后2 h曬青毛茶揮發性香氣物質存在種類和含量上存在明顯的差異。

從表1可以看出，不同類別的揮發物相對含量所占比例存在著差異，主要以醇類、酯類、酮類、萜烯類、含氮類、烷烴類揮發物為主。聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中醇類、酯類、烷烴類、萘、其他類揮發物含量高于聯苯菊酯藥前曬青毛茶，而酮類、萜烯類、含氮類揮發物變化不明顯。說明在聯苯菊酯能影響下醇類、酯類、烷烴類、萘、其他類揮發物含量出現增加現象，而對酮類、萜烯類、含氮類揮發物的影響不明顯。分析其原因：主要是農藥殘留物質不利于含氮化合物和硫化物的轉化，甚至產生一些不良代謝產物和異味物質[32]。

2.2 聯苯菊酯藥后曬青毛茶發酵過程中揮發性香氣物質比較分析

通過將人為噴灑聯苯菊酯后的曬青毛茶分別人工接種釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）及對照組（不接菌）進行固態發酵，將4種固態發酵過程中普洱茶揮發性香氣物質的變化進行比較分析，結果見表2。由表2可知，聯苯菊酯施藥后至發酵結束，不接菌的普洱茶發酵后期出現7種新物質、接酵母菌發酵后期出現9種新物質、接黑曲霉發酵后期出現13種新物質、接產黃青霉發酵后期出現19種新物質；四種處理普洱茶中主要以醇類、酯類、含氮類、萘類物質為主，其中以葉綠醇（9.77%、12.96%、10.15%、10.95%）、1-石竹烯含量（7.47%、20.09%、8.53%、11.41%）最高。

表2 聯苯菊酯藥后處理4種固態發酵過程茶葉中24種揮發性成分的變化Fig.2 Changes of 24 volatile components in the tea during four kinds of solid-state fermentation process after bifenthrin treatment

續表

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聯苯菊酯施藥后接菌和不接菌的發酵過程中，24種主要的揮發性物質（藥后2 h和出堆樣中檢測出）的變化規律存在一定的相似性和差異性。在4種固態發酵情況下，丁香花氣味的1-石竹烯含量都呈現增加趨勢，不接菌處理的增加量（8.7%）低于接種釀酒酵母（192.4%）、黑曲霉（24.2%）、產黃青霉（66.09%）；具強的木香、花香、萜香、青香氣芳樟醇、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ），α-松油醇、三十七醇、葉綠醇、2,7-二甲基萘、1,3-二甲基萘、2,6,10-三甲基十四烷、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、（Z,Z,Z）-亞麻酸甲酯、月桂酸異辛酯含量呈現下降趨勢，不接菌處理的下降量（93.75%、59.55%、62.04%、96.62%、76.34%、54.14%、100%、100%、100%、82.31%、73.49%、74.58%、80.19%）高于接種釀酒酵母（87.17%、22.06%、30.01%、91.40%、72.22%、39.13%、91.17%、95.13%、91.81%、74.08%、72.70%、72.91%、65.16%）、黑曲霉（90.28%、34.90%、45.97%、95.40%、66.80%、52.38%、93.41%、92.04%、86.74%、75.58%、70.31%、69.26%、74.89%）、產黃青霉（89.53%、42.10%、59.52%、93.04%、70.54%、48.60%、91.91%、90.06%、87.66%、75.98%、68.56%、68.81%、72.24%）。這與國外關于殘留農藥對葡萄酒品質的影響結果類似[34-35]。

聯苯菊酯藥后至發酵結束，在不接菌的普洱茶中順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、2,7-二甲基萘、1,3-二甲基萘、（E）-香葉基丙酮、2,6,10-三甲基十四烷未檢出。

聯苯菊酯藥后至發酵結束，具有令人愉快的氣味，類似于薄荷、樟腦味的長葉薄荷酮和三甲基乙酸香芹烯酯只有在接種釀酒酵母（0.30%、1.19%）、黑曲霉（0.27%、0.76%）、產黃青霉（0.28%、0.79%）的普洱茶中檢測出；11-十六炔-1-醇、亞麻酸在4種固態發酵情況下都有檢測出，其不接菌處理的含量（1.74%、0.95%）低于接種釀酒酵母（2.77%、0.98%）、黑曲霉（3.45%、1.52%）、產黃青霉（2.78%、1.99%）。

目前，微生物對普洱香氣的影響主要是導致其產生了大量的甲氧基苯類化合物，劉通訊等[35]認為，甲氧基苯類及其衍生物能夠有效改善茶葉的粗老味，使普洱茶香味陳醇，是普洱茶陳香的重要特征香氣之一。而在聯苯菊酯農藥存在的情況下，接種釀酒酵母、黑曲霉、產黃青霉、不接菌的情況下均未檢測出甲氧基苯類化合物，說明聯苯菊酯存在的情況下，不利于普洱茶陳香的甲氧基苯類揮發物的產生，不利于普洱茶的陳香氣物質的形成。

結果表明，聯苯菊酯農藥通過影響發酵過程中部分成分的形成對普洱茶的感官質量帶來不良影響，尤其是影響發酵過程中形成的揮發性香氣，不同菌株固態發酵處理情況下揮發性香氣物質存種類和含量存在差異，而微生物參與發酵能改善和提升普洱茶的香氣。

3 結論

本研究通過在云南大葉種曬青毛茶中噴灑聯苯菊酯農藥來研究聯苯菊酯農藥對香氣物質的影響及分別接種釀酒酵母、黑曲霉、產黃青霉、不接菌4種處理方式對普洱茶發酵過程中香氣物質的影響。

結果表明，聯苯菊酯用藥前后曬青毛茶香氣物質存在差異。聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中檢測出14種新產生的獨有的揮發性物質，聯苯菊酯藥前和聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中共有組分有32種，說明聯苯菊酯能誘導曬青毛茶內含揮發性香氣物質發生變化。聯苯菊酯藥后產生的揮發物在種類和數量上都有很大的變化，揮發物的種類發生變化（藥前曬青毛茶中存在的14種香氣物質在藥后2 h未檢測到，并且新產生14種香氣物質）、含量上升（178.89%上升至244.25%），各組分占所有檢測到的物質的比例也發生變化，并且對于同一種化合物二者（藥前和藥后2 h曬青毛茶）在含量上也存在很大差異，有增有減。各揮發物組分在施用農藥后相對含量的變化情況不同，這可能是由于其合成途徑的差異造成的。

不同類別的揮發物相對含量所占比例存在著差異，主要以醇類、酯類、酮類、萜烯類、含氮類、烷烴類揮發物為主。OTTENEDER H等[32]研究表明，農藥殘留物質不利于含氮化合物和硫化物的轉化，甚至產生一些不良代謝產物和異味物質。本研究也發現聯苯菊酯藥后2 h曬青毛茶中醇類、酯類、烷烴類、萘、其他類揮發物極顯著的高于聯苯菊酯藥前曬青毛茶，而酮類、萜烯類、含氮類揮發物變化不明顯；藥前和藥后2 h曬青毛茶中相對含量最大的是葉綠醇、芳樟醇、α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、水楊酸甲酯。說明聯苯菊酯能誘導醇類、酯類、烷烴類、萘、其他類揮發物含量的增加，對酮類、萜烯類、含氮類揮發物的影響不明顯。

4種發酵處理情況下揮發性香氣物質存在差異。不接菌的普洱茶發酵后期出現7種新物質、接種酵母菌發酵后期出現9種新物質、接種黑曲霉發酵后期出現13種新物質、接種產黃青霉發酵后期出現19種新物質，說明接種微生物能增加香氣物質的種類，并提升普洱茶的香氣，關于香氣物質增加原理有待進一步深入研究。接酵母菌發酵的普洱茶中具有丁香花氣味的1-石竹烯含量（20.09%）最高，具強的木香、花香、萜香、青香氣芳樟醇（3.27%）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅰ，3.13%）、環氧芳樟醇（芳樟醇氧化物Ⅱ，3.53%）、具有令人愉快的氣味，類似于薄荷、樟腦味的長葉薄荷酮（0.30%）等香氣物質的含量都高于接種黑曲霉、產黃青霉的普洱茶中，而接種3株菌的普洱茶中這些香氣物質含量都高于不接菌的普洱茶。其中，接種酵母菌的普洱茶花果香顯著，香氣最好。