響應面法優化納豆激酶發酵培養基

潘冬梅，張心青，楊傳倫，王紅霞，楊丹丹，田杰偉，王秀芝，高保軍，馬春峰，于帥帥，牟文杰

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.京博農化科技有限公司，山東 濱州 256500）

血栓性疾病是指血液有形成分在血管內形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，或是血栓脫落，在隨血流移動的過程中部分或全部堵塞某些血管，造成相應部位血液供應障礙的一種疾病。血栓性疾病嚴重威脅人類的生命健康，其發病率高居各種疾病之首，且近年來還有漸增之勢[1]，是當代醫學研究的重點和熱點之一。

納豆激酶（nattokinase，NK）是由納豆芽孢桿菌發酵產生的一種絲氨酸蛋白酶[2]，具有溶解血栓作用，同時還具有多種作用，KAMIYA S等[3]研究發現納豆激酶通過延長雌性大鼠血管堵塞時間，達到機體不易形成血栓而預防血栓的作用[4-5]；HSIA C H等[6]研究發現納豆激酶可降低心血管疾病且無副作用；吳杰忱等[7]研究發現納豆激酶可治療高血壓、預防肢體水腫和深靜脈血栓疾病的發生；JI H R等[8]研究發現納豆激酶可預防和治療糖尿病及骨質疏松疾?。籉UJITA M等[9]研究發現納豆激酶具有避免大腦局部缺血的作用；KIM W等[10]研究發現納豆激酶具有抗菌活性；HSU R L等[11]研究發現納豆激酶具有治療阿爾茨海默病的潛在醫學作用；除此之外，納豆激酶在工業上的應用也有很多研究，WANG S L等[12]納豆激酶可以用于工業垃圾的處理；WANG S L等[13-15]研究發現納豆激酶可以作為工業添加劑；NGUYEN T T等[16]顯示納豆激酶作為洗滌劑有顯著效果。目前科學家研究最多的還是納豆激酶的溶栓特性。

納豆激酶已經顯示出巨大的應用前景，但是納豆激酶目前的發酵水平不高，造成以納豆激酶為主要成分的產品價格昂貴，限制了其應用。發酵培養基的優化對提高納豆激酶產量、降低發酵生產成本發揮著重要作用，高澤鑫[17]采用高酶活菌株GUJN05固態發酵36 h后的納豆激酶活力達到（141.97±0.64）FU/g，相比KIM J Y等[18]報道的20～80歲高血壓患者口服納豆激酶膠囊（2 000 FU/d）8周后，舒張壓和收縮壓均較對照組（服用安慰劑）明顯降低，成品制備所需納豆激酶活力還有一定差距。因此，提高納豆激酶的發酵水平是當前納豆激酶研究領域中亟待解決的問題。

本研究在單因素試驗優化納豆激酶培養基的基礎上，以發酵液納豆激酶活力為響應值，利用響應面法對其培養基成分進行優化，以期提高酶活，為實現納豆激酶的大規模生產及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）：由本實驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、甘油、無水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、L-甲硫氨酸：國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

種子培養基：胰蛋白胨10.00 g/L，牛肉膏3.00 g/L，氯化鈉5.00 g/L。

發酵基礎培養基：蔗糖20.00 g/L，胰蛋白胨20.00 g/L，無水氯化鈣0.10 g/L，七水硫酸鎂0.60 g/L，十二水磷酸氫二鈉4.00 g/L，無水磷酸二氫鉀1.00 g/L。

以上培養基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；HC-2518R高速冷凍離心機：科大創新有限公司中佳分公司；SW-CJ-1FB超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

挑取1環納豆芽孢桿菌菌株的新鮮斜面接種于裝有100 mL種子培養基的500 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養24 h（OD600nm值=1.5～1.6）。

1.3.2 發酵方法

將種子液按5%接種于裝有100 mL發酵培養基的500 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養96 h后，發酵液10 000 r/min離心10 min后，取上清液用于納豆激酶活力的測定。

1.3.3 納豆激酶活力的測定

采用紫外分光光度法測定納豆激酶活力[17]，向試管中加入1.4 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.8）緩沖液和0.4 mL纖維蛋白原溶液（7.2 mg/mL），37 ℃溫育5 min后加入0.1 mL凝血酶（20 U/mL），再37 ℃溫育10 min形成人工血栓，加入0.1 mL的待測樣品，37 ℃溫育60 min，加入2 mL三氯乙酸（0.2 mol/L）溶液靜置20 min終止反應，13 000 r/min離心10 min，取上清液于275 nm 波長處測定吸光度值。酶活定義：每分鐘波長275 nm處吸光度值增加0.01所需要的酶量定義為1個單位（FU）的纖維蛋白降解酶活力。

1.3.4 培養基配方優化試驗設計

（1）單因素試驗

碳源對納豆激酶活力的影響：在發酵培養基基礎上，分別以20.00 g/L的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘油為唯一碳源，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養96h后測定納豆激酶活力，并改變篩選碳源添加量（10.00g/L、20.00 g/L、30.00 g/L、40.00 g/L、50.00 g/L、60.00 g/L）繼續培養，以確定發酵培養基中碳源種類及最佳添加量。

氮源對納豆激酶活力的影響：在最優碳源的基礎上，在發酵培養基基礎上，分別以20.00 g/L的胰蛋白胨、豆粕粉、酵母粉、魚粉、玉米漿干粉為唯一氮源，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養96 h后測定納豆激酶活力，并改變篩選氮源添加量（10.00 g/L、20.00 g/L、30.00 g/L、40.00 g/L、50.00 g/L）繼續培養，以確定發酵培養基中氮源種類及最佳添加量。

無機鹽對納豆激酶活力的影響：以不加無機鹽為對照，在發酵培養基基礎上，分別添加0.10 g/L的無水氯化鈣、七水硫酸鎂、七水硫酸鋅、七水硫酸亞鐵、五水硫酸銅、十二水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀，種子液按5%接種，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養96 h后測定納豆激酶活力，并改變篩選無機鹽添加量繼續培養，以確定發酵培養基中無機鹽種類及最佳添加量。

氨基酸對納豆激酶活力的影響：以不加氨基酸為對照，在發酵培養基基礎上，分別添加0.10 g/L的酪氨酸、半胱氨酸、L-甲硫氨酸、谷氨酸、色氨酸，種子液按5%接種，37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養96 h后測定納豆激酶活力，并改變篩選氨基酸添加量（0.10 g/L、0.20 g/L、0.30 g/L、0.40 g/L、0.50 g/L）繼續培養，以確定發酵培養基中氨基酸種類及最佳添加量。

（2）Plackett-Burman試驗[19]

將初始發酵培養基中的7個組分作為影響因素進行全面考察，選擇11個因子及試驗次數N=12的試驗設計，實際變量包括A（甘油）、B（豆粕粉）、C（無水氯化鈣）、D（十二水磷酸氫二鈉）、E（無水磷酸二氫鉀）、F（七水硫酸鎂）、G（L-甲硫氨酸），H、J、K、L作為4個虛擬變量以估計試驗誤差，每個因素取高低2個水平（表1），每組試驗3個重復取平均值。

表1 培養基配方優化Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design for medium formula optimziation

續表

（3）最陡爬坡試驗

最陡爬坡法以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定步長長短，能快速、經濟地逼近最佳值區域[20]。根據（2）Plackett-Burman篩選的顯著性影響因素，進行最陡爬坡試驗。

（4）響應面試驗

響應面分析法確定最佳培養基配方：以爬坡試驗結果確定因素取值進行Box-Behnken中心組合設計（表2），用軟件Design-Expert 8.0.6對試驗進行回歸分析[21]，得出響應面分析結果，進而確定最佳培養組分含量，最后依據回歸方程繪制響應面分析圖。

表2 培養基配方優化Box-Behnken試驗設計因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design for medium formula optimziation

1.3.5 數據處理與分析

采用Design-Expert 8.0.6進行數據處理與分析，采用Excel 2016進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 碳源對納豆激酶活力的影響

碳源對納豆激酶活力的影響見圖1。

圖1 碳源對納豆激酶活力的影響Fig.1 Effects of carbon sources on nattokinase activity

由圖1可知，不同碳源對納豆激酶活力的影響為甘油＞葡萄糖＞蔗糖＞麥芽糖＞乳糖，以甘油為發酵培養基唯一碳源時納豆激酶活力最高為1 127 FU/mL，所以發酵培養基碳源選擇甘油。不同甘油添加量對納豆激酶活力的影響見圖2。

圖2 甘油添加量對納豆激酶活力的影響Fig.2 Effects of glycerol addition on nattokinase activity

由圖2可知，納豆激酶活力隨著甘油添加量的增加而先上升后下降，甘油添加量為50.00 g/L時納豆激酶活力最高，為1 512 FU/mL，故選擇發酵培養基碳源為50.00 g/L的甘油。

2.1.2 氮源對納豆激酶活力的影響

不同氮源對納豆激酶活力的影響見圖3。

圖3 氮源對納豆激酶活力的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on nattokinase activity

由圖3可知，不同氮源對納豆激酶活力的影響為豆粕粉＞玉米漿干粉＞魚粉＞胰蛋白胨＞酵母粉，豆粕粉為發酵培養基唯一氮源時，納豆激酶活力最高1 786 FU/mL，所以選擇發酵培養基的氮源為豆粕粉；考察不同豆粕粉添加量對納豆激酶活力的影響見圖4。

由圖4可知，納豆激酶活力隨著豆粕粉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，添加量為30.00 g/L時納豆激酶活力最高，為1 885 FU/mL，故選擇發酵培養基氮源為30.00 g/L的豆粕粉。

圖4 豆粕粉添加量對納豆激酶活力的影響Fig.4 Effects of soybean meal addition on nattokinase activity

2.1.3 無機鹽對納豆激酶活力的影響

不同無機鹽對納豆激酶活力的影響見圖5。由圖5可知，不同無機鹽對納豆激酶活力的影響為無水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀促進了納豆激酶活力，七水硫酸鋅、七水硫酸亞鐵、五水硫酸銅抑制了納豆激酶活力。

圖5 無機鹽對納豆激酶活力的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on nattokinase activity

選擇對納豆激酶活力有促進作用的無機鹽：無水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀逐個進行添加量試驗，結果見圖6。

圖6 不同無機鹽添加量對納豆激酶活力的影響Fig.6 Effects of inorganic salt addition on nattokinase activity

由圖6可知，選擇發酵培養基中各無機鹽的質量濃度為無水氯化鈣0.20 g/L、七水硫酸鎂0.80 g/L、十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L、無水磷酸二氫鉀1.00 g/L。

2.1.4 氨基酸對納豆激酶活力的影響

不同氨基酸對納豆激酶活力的影響見圖7。由圖7可知，L-甲硫氨酸、谷氨酸促進了納豆激酶活力，酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸抑制了納豆激酶活力，發酵培養基氨基酸選擇促進納豆激酶活力力度最大的L-甲硫氨酸，納豆激酶活力最高2 101 FU/mL。

圖7 氨基酸對納豆激酶活力的影響Fig.7 Effects of amino acids on nattokinase activity

不同添加量的L-甲硫氨酸對納豆激酶活力的影響見圖8。由圖8可知，隨著L-甲硫氨酸添加量的增加，納豆激酶活力呈現先升高后降低的趨勢，添加量為0.2 g/L時，納豆激酶活力最高為2 165 FU/mL，故選擇發酵培養基的氨基酸為0.2 g/L的L-甲硫氨酸。

圖8 L-甲硫氨酸添加量對納豆激酶活力的影響Fig.8 Effects of L-methionine addition on nattokinase activity

通過單因素優化試驗，得到的納豆激酶發酵培養基為甘油50.00 g/L、豆粕粉30.00 g/L、無水氯化鈣0.20 g/L、七水硫酸鎂0.80 g/L、十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L、無水磷酸二氫鉀1.00 g/L、L-甲硫氨酸0.20 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗設計結果與分析

Plackett-Burman試驗設計及響應值（納豆激酶活力R1）見表3，方差分析結果見表4，根據試驗結果得到回歸方程（1）。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis results of Plackett-Burman experiments

模型決定系數R2=0.972 5，模型P值為0.005 7，所得回歸模型極顯著，說明模型擬合性良好[22]。表4中P＜0.05為顯著影響因子，發酵培養基組分對納豆激酶活力具有顯著影響的因子依次是B＞C＞A，即豆粕粉＞無水氯化鈣＞甘油，且3個因素都表現為負效應，濃度可適當降低，將豆粕粉、無水氯化鈣、甘油作為發酵培養基優化的主要因素進行爬坡試驗，其余因素結果可參考單因素試驗結果。

2.3 最陡爬坡試驗

根據回歸方程（1）中A、B、C因素估計系數的效應，依次減小甘油、豆粕粉、無水氯化鈣的濃度，設計最陡爬坡試驗[23]，試驗結果見表5。

由表5可知，隨著甘油、豆粕粉、無水氯化鈣濃度逐漸減少，納豆激酶活力呈現先增大后減小的趨勢。當發酵培養基中甘油為42.50 g/L、豆粕粉為24.00 g/L、無水氯化鈣為0.14 g/L時，納豆激酶活力達到最高，為A、B、C因素的最大響應值區域。以表5中試驗號4的因素水平為中心值進行Box-Behnken中心組合試驗。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest climb experiments

2.4 Box-Behnken中心組合試驗結果與分析

2.4.1 Box-Behnken中心組合試驗結果

根據最陡爬坡試驗結果，選擇試驗號4各因素水平作為Box-Behnken中心組合試驗的中心點進行響應面試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗，試驗點共包括12個析因點和5個零點重復，Box-Behnken設計及結果分析見表6和表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 Box-Behnken試驗回歸分析結果Table 7 Regression analysis results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert 8.0.6軟件對中心組合試驗結果進行響應面分析，得到納豆激酶活力（R2）對甘油（A）、豆粕粉（B）、無水氯化鈣（C）的多元二次回歸方程（2）：

模型決定系數R2=0.956 1，調整決定系數R2Adj=0.899 7，模型P值為0.000 6，表明模型顯著（P＜0.05），模型可以很好的預測試驗結果[24]。由表7可知，因素A、B、C對納豆激酶活力的線性效應均不顯著；因素A2、B2、C2對納豆激酶活力的線性效應均顯著（P＜0.05）；因素A、B之間對納豆激酶活力的交互影響顯著（P＜0.05），因素A、C和B、C之間對納豆激酶活力的交互影響不顯著（P＞0.05）。

2.4.2 Box-Behnken中心組合試驗分析

利用Design-Expert 8.0 軟件根據多元二次回歸方程繪制了相應的三維響應曲面圖（見圖9）。甘油和豆粕粉對納豆激酶活力的影響，等高線接近橢圓說明兩者交互作用顯著（P＜0.05），甘油和無水氯化鈣對納豆激酶活力的影響，等高線接近圓形說明兩者交互作用不顯著（P＞0.05），豆粕粉和無水氯化鈣對納豆激酶活力的影響，等高線接近圓形說明兩者交互作用不顯著（P＞0.05），用該圖對影響納豆激酶活力的任何兩種因素之間的交互效應進行分析，進而確定因素最佳水平[25]。

圖9 各因素間交互作用對納豆激酶活力影響的響應面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on nattokinase activity

2.5 模型驗證

回歸方程（2）對納豆激酶活力Box-Behnken 響應面試驗擬合良好，采用Design-Expert 8.0.6軟件分析，當培養基甘油添加量43.28 g/L，豆粕粉添加量23.60 g/L，無水氯化鈣添加量0.14g/L時，發酵納豆激酶活力預測值為4 242 FU/mL。為了驗證納豆激酶活力模型的有效性，同時為了實際操作可控，設置甘油添加量為43 g/L，豆粕粉添加量為24 g/L，無水氯化鈣添加量為0.14 g/L。在該優化條件下進行搖瓶試驗，試驗重復3次，納豆激酶活力實際值為（4 281±103）FU/mL與預測值基本一致。利用最優發酵培養基發酵納豆激酶活力是優化前（2 164 FU/mL）的1.97倍。

3 結論

本研究通過Plackett-Burman設計，快速有效地從7個影響納豆激酶含量的因素中篩選出3個顯著性影響因素：甘油、豆粕粉、無水氯化鈣，然后利用最陡爬坡試驗得到最大響應值區間并用Box-Behnken設計得出最佳培養基為：甘油43 g/L，豆粕粉24 g/L，無水氯化鈣0.14 g/L，七水硫酸鎂0.80 g/L，十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L，無水磷酸二氫鉀1.00 g/L，L-甲硫氨酸0.20 g/L。在最佳培養基組合下，發酵納豆激酶活力含量達到（4 281±103）FU/mL，是優化前的1.97倍。