玫瑰果格瓦斯發酵工藝優化

崔雅溦，劉 軍，董桂芝，雷勝明，孟憲水，劉云國

（1.新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.平陰玫瑰研究所，山東 平陰 250407；4.濟南紫金玫瑰股份有限公司，山東 平陰 250400）

玫瑰果（Rosa caninaL.）是薔薇屬植物的果實，在許多地區被用作藥物或者藥物補充劑。例如，羅馬尼亞人將其當作是維生素A和維生素C的輔助食品[1]；土耳其人也將其當作是主要的草本植物[2]；我國關于玫瑰果藥效的記載最早出現在距今兩千多年的《神農本草經》中[3]。玫瑰果的顏色呈鮮紅色，是玫瑰花凋謝之后由花托發育而成的肉質漿果[4]，是公認的富含維生素C的植物[5]。不僅如此，玫瑰果中的酚類化合物和礦物質含量都很高，這也使得玫瑰果成為了良好的保健品原料。

格瓦斯（Kvass）是東歐的一種傳統飲料，通常由黑麥或者黑麥面包通過自然發酵而成[6]。該飲料通過未完成酒精和乳酸混合發酵獲得。它是一種無酒精或低酒精的飲料，其酒精度一般不超過1.5%vol[7]，但大部分文獻報道說不能超1.2%vol[8]。格瓦斯富含人體所需的多種營養成分[9-10]，格瓦斯中含有鈣、磷、鎂、鐵、鋅、高鉀、低鈉、和硒等礦物質。作為發酵產品，格瓦斯還富含大量酚類化合物，這些酚類和黃酮類化合物具有抗氧化劑和自由基清除劑的作用，也被認為能夠預防癌癥、腫瘤、糖尿病、衰老和神經系統疾病[11]。同時，格瓦斯也是生物活性肽的來源，通過蛋白水解培養物發酵釋放。因此格瓦斯也是潛在的保健食品，它能改善消化、內分泌、心血管、免疫和神經系統疾病[12]。最近有研究表明，格瓦斯對于脾胃虛寒型胃潰瘍導致的胃粘膜損傷有一定的拮抗作用，能有效修復胃部損傷，緩解胃潰瘍現象[13]。此外，作為一種乳酸菌發酵產物，格瓦斯也具有調節腸道，防止病原菌繁殖和改善新陳代謝的作用[14]。

近年來，由于消費者口味的變化和對新品發酵飲料感官的尋求，越來越多的人喜歡飲用低醇飲料。研究表明，低醇飲料不僅不會造成酒精的攝入過量，還可以促進營養成分（B族維生素、礦物質和酚類物質）的吸收[15]。因此國內外開始對混菌發酵低醇飲料進行了大量的研究，尤其是酵母行業。一些研究表明，使用非釀酒酵母混合釀酒酵母發酵不僅有助于降低乙醇含量，而且它能產生更佳復雜的“風味表型”，據報道，非釀酒酵母能夠產生超過1 300種揮發性化合物[16-17]。因此非釀酒酵母對產品來說非常重要，這些獨特感官就是每種產品的典型特征[18-19]。目前，使用單一釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）接種發酵已經成為現代釀造業的普遍做法，這樣做雖然保證了快速可靠的發酵過程，但是這也導致了發酵產品風味單一缺點[20]。研究表明，如果在釀造過程中引入非釀酒酵母可能會對格瓦斯的風味產生一些積極的影響[21]。

本試驗以玫瑰果和兩種麥芽為主要原料，接入庫德里阿茲威畢赤酵母、釀酒酵母和植物乳桿菌進行發酵。采用單因素及響應面試驗設計，以酒精度和總酸含量為評價指標，進行發酵工藝優化。為玫瑰果格瓦斯產業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥芽、焦香麥芽：淄博塔斯曼釀酒原料有限公司；玫瑰果：濟南紫金玫瑰有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）、正丁醇標準品（純度99%）：北京索萊寶科技有限公司；糖化酶（10萬U/g）：阿拉丁生物試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（SC）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（PK）：臨沂大學生命科學學院食品實驗室菌種庫。

1.2 儀器與設備

LC-1L拍打式無菌均質機：青島英瑞斯特實驗儀器有限公司；Therom TSQ 8000EVO氣質聯用儀：賽默飛世爾科技公司；固相微萃取手柄、固相微萃取裝置、65 μm PDMS/DVB手動固相微萃取頭、7890B氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）：安捷倫科技有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；WAY（2WAJ）阿貝折光儀：上海儀電物光有限公司；PHS-3CINESApH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；LC-LX-H185C 臺式高速離心：上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰果格瓦斯加工工藝流程與操作要點

麥汁的制備：將研磨過篩的大麥芽粉和焦香麥芽粉按7∶3的質量比混合并加入適量的水，然后加入α-淀粉酶進行60 ℃液化30 min，之后加入糖化酶60 ℃糖化30 min。過濾后采用121 ℃，15 min高壓滅菌處理。這樣不僅能夠殺滅其中的細菌還能使麥汁中的部分蛋白發生變性，從而有利于麥汁蛋白以可溶性的形式保留在麥汁中[22]。

玫瑰果果汁的制備：將清洗干凈的玫瑰果去蒂去籽，與水按1∶5（g∶mL）的比例，放入均質機均質10 min。

玫瑰果格瓦斯的制備：取150 mL麥汁，加入20%的玫瑰果果汁和3%的蔗糖。62 ℃巴氏殺菌30 min，制作成發酵原液。冷卻后將菌株按比例和用量接入發酵原液，放入26 ℃恒溫培養箱中進行發酵20 h，得到玫瑰果格瓦斯。

1.3.2 理化指標的測定

可溶性固形物：采用阿貝折光儀進行測定。

總酸：參考GB/T 12456—2008《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中pH電位滴定法測定[23]。

酒精度：參考GB5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中氣相色譜法測定[24]。

1.3.3 發酵工藝優化單因素試驗

采用單因素試驗，初步探究原料液初始可溶性固形物含量（5°Bx、7°Bx、9°Bx、11°Bx、13°Bx），發酵溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃），發酵時間（16 h、18 h、20 h、22 h、24 h），接種量（2%、4%、6%、8%、10%）和菌株LP∶SC∶PK的接種比（1∶1∶1、1.50∶0.75∶0.75、0.75∶1.50∶0.75、0.75∶0.75∶1.50、1.2∶1.2∶0.6、0.6∶1.2∶1.2、1.2∶0.6∶1.2）對玫瑰果格瓦斯酒精度和總酸含量的影響。

1.3.4 發酵工藝優化響應面法

（1）Plackett-Burman試驗設計

基于單因素試驗確定5個影響因素（初始可溶性固形物含量、發酵溫度、發酵時間、接種量、接種比）的Plackett-Burman試驗的最高水平和最低水平。設計N=12的Plackett-Burman試驗設計，響應值為酒精度和總酸含量。此外還包括6個虛擬變量（F、G、H、J、K、L），主要用于計算隨機測量誤差。通過使用Design-Expert 11.1.0.1軟件計算P值，使用隨機測量誤差來確定實際值的顯著性。添加兩個連續因子作為中心點，以評估系數的標準誤差。Plackett-Burman試驗因素與水平見表1。

表1 玫瑰果格瓦斯發酵工藝優化Plackett-Burman試驗設計結果Table 1 Results of Plackett-Burman experimental design for rosehip Kvass fermentation technology optimization

（2）Box-Behnken試驗設計

在Plackett-Burman試驗的基礎上，以初始可溶性固形物含量、發酵溫度和發酵時間為考察因素，根據Box-Behnken試驗設計原理，進行3因素3水平的響應面分析試驗。自變量取值及其編碼見表2。

表2 玫瑰果格瓦斯工藝優化Box-Benhnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for rosehip Kvass fermentation process optimization

1.3.5 數據處理

所有試驗做三次平行，數據以“平均值±標準差”表示；使用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 26.0進行單因素試驗的方差分析和差異性分析；使用Design-ExpertVersion 11.1.0.1軟件進行Plackett-Burman和Box-Behnken試驗結果的分析；使用Graph Pad Prism 8.4.3制圖。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 初始可溶性固形物含量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

初始可溶性固形物含量會影響格瓦斯的總酸含量和酒精度[25]。因此，固定發酵溫度28 ℃，發酵時間24 h，接種量2%和接種比（LP∶SC∶PK）1∶1∶1，觀察不同初始可溶性固形物含量對發酵的影響，結果見圖1。由圖1可知，酒精度隨初始可溶性固形物含量的增加呈現先增加后下降到趨勢。當初始可溶性固形物含量達到11°Bx時，酒精度達到最大，此時酒精度為1.28%vol。這說明初始可溶性固形物含量過大會抑制酵母的生長，這與前人得出的結論一致[6]。總酸含量沒有明顯的變化趨勢，所有試驗組的總酸在5.84～6.29 g/L的范圍內。格瓦斯酒精度一般小于1.5%vol，但由于酒精度低于1%vol造成了發酵不充分，產生了濃烈的不良麥汁氣味。因此，選取7°Bx和11°Bx為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖1 初始可溶性固形物含量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.1 Effects of initial soluble solid contents on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.2 發酵溫度對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

溫度是影響發酵制品感官評價的重要指標，一般情況，發酵溫度控制在25～35 ℃。溫度過低，發酵時間會延長；溫度過高會縮短發酵時間，但是會降低發酵酒品質，影響其口感[26]。基于初始可溶性固形物含量9°Bx，其他條件不變進行發酵，考察不同發酵溫度對發酵的影響，結果見圖2。由圖2可知，總酸含量和酒精含量隨溫度的增加而繼續增加。當溫度超過28 ℃之后，酒精度會超過1.5%vol，引起格瓦斯變質。因此，選擇20 ℃和28 ℃為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖2 發酵溫度對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.3 發酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

確定初始可溶性固形物含量9°Bx，發酵溫度28 ℃，考察不同發酵時間對發酵結果的影響，結果見圖3。由圖3可知，總酸含量和酒精度都呈上升趨勢，從16 h到24 h，總酸含量和酒精度分別增加39.4%和11.1%。整體上看溫度對這兩個影響因素影響較大。因此，選取16 h和24 h為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖3 發酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.3 Effects of fermentation time on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.4 接種量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

其他條件不變，固定發酵時間為24 h，分別按不同的接種量進行接種，考察接種量對試驗結果的影響，結果見圖4。由圖4可知，隨著接種量增加，總酸含量和酒精度變化不大，并且沒有明顯的變化趨勢。綜合總酸含量和酒精度，選取接種量為2%和8%為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖4 發酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.4 Effects of inoculum on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.5 接種比對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

按照LP∶SC∶PK不同的接種比例進行發酵，確定接種量為6%，其他條件不變，考察接種比對發酵結果的影響，結果見圖5。由圖5可知，當接種比為1∶1∶1時，總酸含量達到最大，為6.12 g/L。此時酒精度較低為1.19%vol；當接種比為0.75∶1.50∶0.75時，總酸含量最小，為4.76 g/L。此時，酒精度大于1.5%vol，格瓦斯變質。接種比為0.6∶1.2∶1.2的組的酒精度僅次于0.75∶1.50∶0.75，此比例時總酸含量較低為4.777 g/L，僅次于接種比0.75∶1.50∶0.75的組。因此，最終選取1∶1∶1和1.2∶0.6∶1.2為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖5 接種比對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.5 Effects of inoculation ratio on total acid content and alcohol content of rosehip Kvass

2.2 發酵工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果分析

Plackett-Burman試驗結果見表3。利用Design-Expert 11.1.0.1軟件分別對酒精度和總酸含量進行響應面回歸模型方差分析，結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計結果Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design

由表4可知，以酒精度為評價指標，該模型極顯著（P值=0.000 1＜0.001），失擬項不顯著（P值=0.187 0＞0.05），該模型決定系數R2=97.22%，調整決定系數R2adj=94.90%，說明該模型的的擬合度較好。根據F值和P值可知，初始可溶性固形物含量、發酵溫度和時間為影響格瓦斯酒精度的顯著因素。以總酸為評價指標，該模型極非常顯著（P值=0.003 1＜0.01），失擬項不顯著（P值=0.078 9＞0.05），該模型決定系數R2=91.97%，調整決定系數R2adj=85.28%。可知此模型有意義，可以用此模型對格瓦斯發酵條件進行分析。根據F值和P值可知，影響格瓦斯總酸含量的主因素為發酵溫度和時間。綜上所述，初始可溶性固形物含量，發酵溫度和時間為此次試驗研究的主要影響因素，為下一步Box-Behnken試驗優化建立了基礎。

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman experiments results

2.2.2 Box-Behnken試驗結果分析

格瓦斯發酵條件優化響應面試驗結果見表5，回歸模型方差分析結果見表6。

表5 Ben-Behnken試驗設計結果Table 5 Results of Ben-Behnken experiments design

酒精度是格瓦斯發酵的一個關鍵因素，根據表6可知，酒精度的二次模型的F值為63.42（P＜0.001），對結果影響極顯著。失擬值的P值為0.187，表明失擬項不顯著，說明該模型合理。其次，決定系數R2=99.13%，調整決定系數R2adj=97.57%，說明此模型可以解釋97.57%的變化，擬合度非常好，可以用此模型對玫瑰果格瓦斯發酵條件進行分析。對表5中結果進行回歸擬合分析，得到玫瑰果格瓦斯發酵過程中酒精度含量的二次回歸方程為：

總酸含量是格瓦斯感官品質的另一個重要指標，總酸含量過低會使格瓦斯失去其獨特的口感，過酸又會降低格瓦斯的品質。表6顯示了因變量和自變量之間的線性關系的重要性。該模型F值為36.35（P＜0.001），極顯著，且失擬項不顯著，表明二次回歸方程可以很好地預測響應值。決定系數R2=98.49%；調整決定系數R2adj=95.78%，表明只有大約4.22%的總方差不能用該模型解釋。總酸含量的二次模型可以用下式表示：

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

一次項A、B和C三個因素對酒精度均有著極顯著影響（P＜0.001），交互項AB、二次項A2、B2和C2對酒精度的影響均顯著（P＜0.05）。一次項B、二次項C2對總酸含量影響極顯著（P＜0.001），一次項C、二次項A2對結果影響非常顯著（P＜0.01）。交互項BC和二次項B2對總酸含量影響均顯著（P＜0.05）。

圖6 各因素間交互作用對玫瑰果格瓦斯酒精度和總酸含量影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the alcohol content and total acid content of rosehip Kvass

格瓦斯的酒精度一般低于1.5%vol，但格瓦斯酒精度過低時，產品中很難產生醇香的味道，并且麥汁味道會過重[27]，酒精度過高時又會使產玫瑰果格瓦斯的酒味過重。因此在保證酒精度在1.0%vol和1.2%vol之間，這樣才能保證產品獲得更加濃郁的醇香。格瓦斯的酸味也是感官評價中的重要指標，既要體現出乳酸的味道也不能酸味過重，因此把總酸含量定為4 g/L最好[6]。在響應面試驗中設置總酸目標值為4 g/L，同時設置酒精度范圍為1.0%vol～1.2%vol，根據模型計算，初始可溶性固形物含量、發酵溫度和時間的最優值分別為8.002°Bx、26.517 ℃、20.483 h，根據實際操作條件，將其分別調整為8°Bx、26 ℃、20 h，其他條件為接種量2%，接種比為1∶1∶1。并得到此模型預測的酒精度和總酸含量分別為1.047%vol和4 g/L。

2.3 發酵工藝的驗證

為了驗證該模型是否可靠，將模型得到的最優工藝（初始可溶性固形物含量8°Bx，發酵溫度26 ℃，發酵時間20 h）進行驗證。該組試驗有6個平行，最終測得酒精度的實際值為1.09%vol，總酸含量的實際值為4.02 g/L。與理論值相差不大，由此可知，該響應面模型有效，可以預測玫瑰果格瓦斯發酵的最佳工藝，具有一定的實踐指導意義。

3 結論

本研究以玫瑰果和麥芽為原料研制玫瑰果格瓦斯，通過單因素和響應面優化試驗設計對玫瑰果格瓦斯的發酵工藝進行優化。最終確定最優發酵工藝為初始可溶性固形物含量8°Bx，發酵溫度26 ℃，發酵時間20 h，三種菌株總接種量2%，接種比為1∶1∶1。此優化條件下，玫瑰果格瓦斯酒精度為1.09%vol，總酸含量為4.02 g/L。為玫瑰果格瓦斯的大規模生產提供了有力的數據支撐。