雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料的研制

王紫琳，方 冉，趙存朝，2，楊 敏，陶 亮，2*，田 洋，2，3

（1.云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.國家辣木加工技術研發專業中心，云南 昆明 650201；3.食藥同源資源開發與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201）

雪蓮果（Smallanthus sonchifolius），學名亞貢（yacon），為菊科向日葵屬雙子葉草本植物，原產于南美洲西部的安第斯山脈[1]。雪蓮果肉質晶瑩如玉，口感甜脆，低聚果糖的含量極高，具有“低聚果糖之王”的美稱[2]。雪蓮果汁液豐富，適宜作為飲料、果汁等產品原料，其含有多種人體所需的營養成分，具有抗氧化[3]、調節胃腸道功能[4]、降血糖[5]、降血脂[6]等功效，具有極高的開發利用價值。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是革蘭氏陽性菌的一種，屬于乳桿菌科（Lactobacillaceae）中的乳桿菌屬（Lactobacillus），具有較高的蛋白酶活，能分解多種大分子蛋白質和碳水化合物，產生小分子多肽及低聚糖類，提高其營養價值，促進營養物質的吸收[7]。植物乳桿菌及其代謝產物對促進人體健康具有一定作用，如平衡腸道菌群，預防和治療腸易激綜合征[8]、緩解感冒癥狀[9]、抗糖尿病[10]等功效。

植物基發酵飲料指以植物、發酵菌等為原料，通過微生物發酵獲得的特定生物活性成分制成的產品[11]。近年來，植物發酵制品風靡全球，微生物發酵促進了底物分解轉化，可以改善食品風味，提高營養價值[12]。作為21世紀新型保健功能飲料，植物發酵飲料營養價值高、保健效果好，能夠滿足人們對生活品質的追求和健康的飲食習慣。發酵后的果蔬不僅能提高其風味，還會產生豐富的氨基酸等成分，提升原料的質感，增加風味復雜度和飽和度，同時還能天然降糖，有助于人體健康[13]。隨著消費不斷的升級、消費群體的不斷細分、消費方案逐漸細化和多樣化，功能飲料的開發將得到持續的支持和推動。將功能、口感、飲用場景與發酵結合可能會是飲料企業下一步的研究方向和熱點。當前市場上常見的雪蓮果加工產品主要有果凍[14]、果脯[15]、飲料[16]、糕點[17]等。雪蓮果發酵型飲料的研究較少，將雪蓮果果汁與植物乳桿菌相結合，兼顧了營養與健康，是一款新型特色發酵型飲料產品。

本實驗擬選用雪蓮果為原料，以植物乳桿菌BNCC194165為菌種發酵，利用單因素試驗考察蔗糖添加量、穩定劑添加量、菌種接種量、發酵時間等因素對雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料感官評分和總酸含量的影響，并通過響應面優化設計最佳生產工藝及參數，研制出營養豐富、口感清爽的雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料，豐富了飲料市場品種，拓寬了植物發酵飲料的生產鏈，為雪蓮果的開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪蓮果、蔗糖：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BNCC194165：北京北納創聯生物技術研究院；阿拉伯膠：河南萬邦實業有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：成都萬象宏潤生物科技有限公司；氯化鈉（NaCl）：云南省鹽業有限公司。

1.2 儀器與設備

HT118ATC手持糖度儀：上海楚工實業有限公司；YXQLS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-2F標準型凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250智能生化培養箱：鄭州生元儀器有限公司；FE28數字型pH計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；WT20002電子天平：杭州萬特衡器有限公司；LC-4014低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；JYL-Y6榨汁機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雪蓮果發酵飲料制備工藝流程及操作要點

操作要點：

雪蓮果汁的制備：選擇水分充足，大小適中的新鮮雪蓮果，洗凈后切成大小均勻的塊狀，置于護色液（1.5%NaCl+2%VC）中浸泡1 h，取出榨汁，用60目篩過濾得到雪蓮果汁；

調配：在過篩后的雪蓮果汁中加入8%的蔗糖和0.6%的阿拉伯膠，攪拌成均勻的溶液，過濾除去雜質，得到質地均勻的雪蓮果汁，罐裝入干凈玻璃瓶中。

滅菌：灌裝后放入立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌，主要目的是為了殺死其中有害微生物，防止在后續的發酵過程中干擾微生物的接種發酵，采用100 ℃，滅菌15 min。制成雪蓮果汁調配液，冷卻備用。

菌種活化：將菌種培養液放入依氏燒瓶中，用封口膜密封，將其置入蒸汽滅菌鍋中121 ℃維持15 min，取出后置于超凈工作臺冷卻至37 ℃，接入植物乳桿菌，在培養箱中培養24 h。

發酵：將活化完成的植物乳桿菌接種于冷卻至40 ℃的雪蓮果汁調配液中，密封后放入培養箱中進行發酵。

過濾：將發酵完成的雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料經100目紗布過濾，保留濾液。

罐裝、密封：發酵濾液裝入干凈的玻璃瓶中并密封，防止微生物、雜質進入影響飲料品質。

滅菌、冷卻：采用沸水滅菌15 min，滅菌完畢后放入冷水浴中迅速冷卻至室溫，制成雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料。

1.3.2 試驗設計

（1）單因素試驗

以感官評分及總酸含量為評價指標，考察蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、阿拉伯膠添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、植物乳桿菌接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、發酵時間（12 h、14 h、16 h、18 h、20 h）對雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料品質的影響。

（2）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗基礎上運用Design-expert 8.0.6軟件設計12次的Placket-Burman試驗對蔗糖添加量（X1）、菌種接種量（X2）、發酵時間（X3）、阿拉伯膠添加量（X4）進行感官評分（Y）顯著性考察，每個因素設計高（1），低（-1）2個水平，PB設計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

（3）響應面試驗設計

在Plackett-Burman試驗的基礎上，選取蔗糖添加量（X1）、菌種接種量（X2）、發酵時間（X3）作為響應面試驗的影響因子，以感官評分（Y）作為響應值，通過Box-Behnken設計進行3因素3水平試驗，優化雪蓮果植物乳桿菌發酵工藝，因素及水平見表2。

表2 雪蓮果植物乳桿菌飲料發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

1.3.3 感官評分標準

雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料的感官評定由10名有一定品評經驗的專業人員組成評定小組，分別從組織狀態、氣味、色澤、滋味四項指標對雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料采用百分制打分。評價標準及所占分值見表3，結果取平均感官評分作為綜合評分。

表3 雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料感官評分標準Table 3 Sensory evaluation standards of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

1.3.4 理化指標及微生物指標的測定

總酸測定參考GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》；pH值的測定使用pH計；還原糖的測定參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》。

大腸菌群、菌落總數、霉菌分別按照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》、GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》進行測定。

1.3.5 數據處理

利用Excel 2013、SPSS 19.0統計軟件處理單因素試驗方差分析數據，工藝優化試驗設計采用Design-Expert 8.0.6軟件處理，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蔗糖添加量的確定

飲料中加入蔗糖不僅可以提高飲料甜度，調節甜酸比和苦澀味，還可以提高其黏度和穩定性[18]。蔗糖添加量對產品品質的影響見圖1。由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，感官綜合評價得分呈先增大后減小的變化趨勢，總酸呈逐漸增加的趨勢。當蔗糖添加量為8%時，感官評分最高，為（88.28±0.81）分。當蔗糖添加量為2%時，感官評分最低，為（74.50±0.23）分，原因可能是雪蓮果本身甜度較低，而發酵過程中微生物生長代謝需要消耗一部分糖，同時產生有機酸[19]。蔗糖添加量過低，不利于植物乳桿菌發酵，且果汁過酸，受歡迎度降低。為避免酸甜比例失調，雪蓮果發酵飲料中蔗糖的添加量需要較一般的非發酵類果蔬飲料偏高。因此，確定最適蔗糖添加量為8%。

圖1 蔗糖添加量對產品品質的影響Fig.1 Effect of sucrose addition on product quality

2.1.2 阿拉伯膠添加量的確定

在植物飲料中添加適當的穩定劑可防止沉淀的產生，改善飲料的粘稠度，提高飲料品質和口感。阿拉伯膠具有良好的親水性和親油性，是較好的天然水包油型乳化穩定劑，可提高飲料的溶解度，使飲料更加穩定。因此，選擇阿拉伯膠作為發酵飲料的穩定劑[20]。阿拉伯膠添加量對產品感官品質的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著阿拉伯膠的增加，感官評分呈先增大后減小的變化趨勢，總酸變化趨勢平緩。阿拉伯膠添加量為0.6%時，感官評分最高，為（89.67±0.36）分，這是由于阿拉伯膠可以和蛋白質在酸性條件下發生絡合反應形成帶電復合物，通過靜電斥力防止蛋白質絮凝和沉淀，有助于穩定和提升飲料的組織狀態及風味，并有一定的增稠作用[21]。添加量不足時，酸性蛋白質粒子間壓力和重力平衡性差，仍會產生蛋白質沉淀[22]，添加過多破壞了飲料的穩定體系，影響了產品的流動性及適口性，品質變差。因此，阿拉伯膠最佳添加量為0.6%。

圖2 阿拉伯膠添加量對產品品質的影響Fig.2 Effect of arabic gum addition on product quality

2.1.3 菌種接種量的確定

菌種接種量可以直接影響其在發酵體系中的生長，適當的菌種量可以保證溶氧充分，破壞細胞結構，使發酵液充分發酵[23]；但當菌種量過多時，發酵體系中的微生物含量增加，維持其生長代謝所需的營養物質增多，過量的菌種易產生過量的代謝廢物，影響產品口感[24]。菌種接種量對雪蓮果發酵產品感官質量的影響見圖3。由圖3可知，感官評分隨菌種接種量的增大呈現先增大后減少趨勢，總酸呈逐漸增加的趨勢。在接種量為1%時，組織狀態及風味均較好，感官評分達最高（87.11±0.36）分，隨著接種量繼續增加，產品過酸，口感不柔和，當植物乳桿菌接種量為2.5%時，感官評分最低，為（72.17±0.57）分，原因是植物乳桿菌接種量過多，導致乳酸菌在適宜條件下迅速繁殖，導致蔗糖和雪蓮果汁中糖類迅速消耗，同時產生大量有機酸，使產品酸度過高，影響飲料整體風味和口感。菌種添加量低于1.0%，微生物生長緩慢，代謝效率低，產品風味不足。因此，最優菌種接種量為1%。

圖3 接種量對產品品質的影響Fig.3 Effect of inoculum on product quality

2.1.4 發酵時間的確定

微生物發酵中，發酵時間對發酵體系影響較大，可影響發酵程度和產品品質，也可影響工藝及生產效率，是發酵食品開發中的重要參數。發酵時間過短，發酵不完全；時間過長，又會形成過多的酸性物質，影響飲料的風味。因此，確定合適的發酵時間是制作植物乳桿菌果汁飲品的必需步驟[25]。發酵時間對產品感官品質的影響結果見圖4。由圖4可知，發酵飲料的感官評分隨發酵時間的增加呈先增大后減小的趨勢，總酸呈逐漸增加的趨勢。當發酵時間低于14 h時，飲料產品發酵不徹底，產品風味并未完成釋放，產品品質是隨著發酵時間延長逐漸提升，當發酵時間達到14 h時，飲料組織狀態穩定且口感較好，感官評分達到最高（87.29±0.45）分；隨著發酵時間的繼續延長，產酸量過多，口感變差，尤其是酸澀感明顯，同時伴有少量絮狀雜質產生，影響產品外觀、穩定性及口感風味，感官質量逐漸變差。因此，最適發酵時間為14 h。

圖4 發酵時間對產品品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on product quality

2.2 Plackett-Burman試驗設計及結果

Plackett-Burman試驗設計方法可通過對每個因子取兩水平來進行分析，通過比較各個因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，篩選及確定顯著影響的因子，避免試驗過程中因子數過多或某些因子不顯著造成的實驗資源過度浪費，PB試驗設計與結果見表4。由表4可知，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸方程擬合和方差分析。得到回歸方程為：Y=8.49+1.52X1+0.28X2+0.25X3+0.31X4-0.17X5。PB試驗模型方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 Plackett-Burman試驗模型方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman test model

由表5可知，模型F＞1，P＜0.01，差異性極顯著，表明模型設計合理。X1蔗糖添加量、X2菌種添加量、X3發酵時間對結果影響均為極顯著（P＜0.01），X4阿拉伯膠添加量表現為不顯著（P＞0.05），表明此因子對感官評分的影響不顯著。模型的決定系數R2=97.95%，與調整決定系數R2Adj=96.79%接近，表明該模型可預測性及可信度較高。

根據前期單因素試驗，在以雪蓮果與水的料水比為1∶1的基礎上將因子X4（阿拉伯膠添加量）設置為0.6%，對顯著性因子蔗糖添加量（X1）、菌種添加量（X2）、發酵時間（X3）進行響應面優化試驗，考察其最優水平范圍。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗結果及模型建立

基于Box-Behnken試驗設計，在單因素試驗和Plackett-Burman試驗基礎上，利用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面優化試驗，選取蔗糖添加量（X1）、菌種添加量（X2）、發酵時間（X3）3個因素，以感官評分（Y）為響應值，完成雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料發酵工藝優化，試驗設計及結果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

續表

根據表6的結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行二元回歸方程擬合和方差分析。回歸方程為：Y=86.66+1.64X1+2.81X2+0.36X3-1.26X1X2-1.05X1X3-2.02X2X3-6.52X12-6.62X22-1.99X32。利用Design Expert 8.0.6軟件對表6數據進行分析方差分析，結果見表7。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，該回歸模型的P＜0.000 1，說明回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；模型失擬項不顯著，表明此模型可用于試驗擬合。模型的決定系數R2=0.994 1，表明該模型能解析99.41%的響應變化，說明該模型擬合程度相對較好，試驗誤差較小。響應值Y的變異系數（coefficient of variation，CV）與試驗精確度和重復性成反比，其變異系數CV=0.84%＜5%，說明試驗的精確度和重復性較高，且可信度較高。由F值大小可以得出各因素對飲料感官品質的影響大小順序為X2（菌種添加量）＞X3（發酵時間）＞X1（蔗糖添加量），一次項X2、X3的P值均＜0.01，表明其對飲料感官品質的影響極顯著。

2.3.2 各因素交互作用響應面分析

響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映蔗糖添加量（X1）、菌種接種量（X2）、發酵時間（X3）之間交互作用對雪蓮果植物乳桿菌感官評分的影響。曲面圖弧度變化越陡峭，等高線越密集且呈橢圓形或馬鞍形時，表示兩因素之間交互作用越顯著，各因素交互作用結果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料感官品質影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the sensory quality of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

由圖5、表7可知，交互項X1X2、X2X3的曲面傾斜度較大，坡度較陡，且等高線呈橢圓形，較密集，說明其影響極顯著（P＜0.01），與X1X2、X2X3相比，X1X3曲面傾斜度較小，坡面較平緩（P＜0.05），各因素間交互作用對雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料的感官評分的影響大小依次為X1X2＞X2X3＞X1X3。

2.4 雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料最佳發酵工藝的確定及驗證試驗

經過回歸方程進一步擬合分析預測得出最佳發酵工藝為：蔗糖添加量7.91%、菌種接種量1.10%、發酵時間14.22 h。在此優化條件下，雪蓮果發酵型飲料分值達到（87.26±0.36）分。考慮到實際操作的可行性，將發酵工藝條件修正為：蔗糖添加量8%、菌種接種量1%、發酵時間14 h。在優化發酵工藝條件下進行3次驗證性試驗，感官評分平均實際值為（87.42±0.32）分，與預測值接近，說明響應面優化后得到的最佳發酵工藝參數準確可靠，具有一定的實際應用價值。

2.5 產品質量評價

2.5.1 雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料感官指標

按照最優組合制備雪蓮果發酵飲料，根據感官評分標準進行感官分析。開發的雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料最終產品均勻一致，顏色呈鮮亮的橘黃色，具有雪蓮果及乳桿菌香氣，層次豐富，無異味，酸甜適宜。

2.5.2 雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料理化指標及微生物指標

理化指標及微生物指標見表8。由表8可知，在該工藝下制得的雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料酸甜適中，且微生物指標符合相關國家安全標準。

表8 理化指標及微生物指標結果Table 8 Results of physical and chemical indicators and microbial indicators

3 結論

本研究以雪蓮果為原料，植物乳桿菌BNCC194165為發酵菌種，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗及響應面試驗優化雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料發酵工藝。結果表明，雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料的最佳發酵工藝為雪蓮果與水質量比為1∶1，蔗糖添加量8%、阿拉伯膠添加量0.6%、植物乳桿菌BNCC194165接種量1%、37 ℃發酵14 h的條件下，感官評分為（87.42±0.32）分。按照該工藝所得的雪蓮果植物乳桿菌發酵飲料兼具雪蓮果及植物乳桿菌的清香，清新爽口，酸甜適中，其理化及微生物指標符合相關標注要求，是一款風味品質較佳的發酵型植物飲料。本產品的研發對延伸雪蓮果產業鏈、豐富特色果蔬發酵飲料品類具有一定的意義。