152 例無創產前檢測性染色體異常高風險的遺傳學分析

凌穎聰 孫淑湘 徐進美 莫忠游 陸葉 李秋麗

大量研究表明,無創產前基因檢測對于21 三體綜合征、18 三體綜合征、13 三體綜合征具有較高的敏感性和特異度,是目前準確性最高的非整倍體產前篩查方式。然而NTPT 對于其他常染色體非整倍體、性染色體非整倍體異常、微缺失/微重復的檢出率和陽性預測值目前仍存在較大爭議。本研究對2017～2020 年31130 例參與NIPT 檢測的孕婦結果進行回顧性分析,并對NIPT 篩查結果提示為性染色體異常高風險的152 例孕婦在知情同意下進行羊水染色體檢查(應用核型分析結合CNVs 技術,核型分析結合FISH 技術進行確診),并行追蹤隨訪,探討NIPT 對于篩查性染色體異常的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017～2020 年自愿參與NIPT 檢測的孕婦31130 例。納入標準：經臨床咨詢符合NIPT檢測原則孕12～26 周的孕婦。排除標準：①夫婦一方有明確染色體異常；②1年內接受過異體輸血移植手術,異體細胞治療等；③胎兒超聲檢查提示有結構異常；④有基因遺傳病家族史。

1.2 方法 對NIPT 篩查結果提示為性染色體異常高風險且知情同意的孕婦進行羊水染色體檢查(應用核型分析結合CNVs 技術,或核型分析結合FISH 技術進行確診)。

1.2.1 NIPT 篩查 采集孕婦外周血10 ml,在72 h 內4℃離心10 min 收集上層血漿1600 g,將收集的16000 g血漿常溫離心10 min,再吸取上層血漿,分裝,-80℃保存。利用磁珠法對1200 μl 血漿進行DNA 提取,最終洗脫體積為42 U,使用Qubit3.0 測定DNA 質量濃度。取全部的DNA 溶液進行建庫(PCR-Free),包括末端修復,加接頭,再對文庫進行Real-timePCR 定量,最后通過NextseqCN500 進行測序,對測序數據進行生物信息學分析,計算Z 值,評估胎兒患病風險。

1.2.2 羊水G 顯帶核型分析 B 超引導下行羊膜腔穿刺,取羊水20 ml,置于2 支無菌離心管中,離心后取沉淀的羊水細胞分別無菌接種于5 ml 的羊水培養基,置于37℃二氧化碳培養箱培養7～9 d。收獲細胞后行G 顯帶制片并分析核型,按照《人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN2016》進行描述及報告。

1.2.3 羊水FISH 檢測 取5 ml 羊水,采用美國雅培公司試劑盒,使用探針CEP18/X/Y,按照說明書標準常規操作流程,羊水細胞經預處理、雜交和洗滌復染,置熒光顯微鏡下判斷最后結果,隨機計數50 個細胞(如有嵌合增加計數至400 個),72 h 內出具檢測結果。

1.2.4 染色體CNVs 檢測 采集孕婦外周血,提取基因組DNA,超聲波破碎后進行文庫制備,最后通過NextseqCN500 測序儀完成高通量測序。經生物信息學分析,統計染色體異常的類型,通過將檢測到的CNVs與國際基因組變異數據庫進行對比,排除常見的多態性CNVs,與DECIPHER、OMIM 數據庫進行對比,結合已有的文獻報道,分析其CNVs 是否具有致病性。

1.2.5 隨訪 由本院產前診斷中心護士對所有受檢孕婦進行電話跟蹤隨訪,并記錄妊娠結局。

1.3 觀察指標 分析NIPT 結果、產前診斷結果及NIPT 篩查性染色體異常陽性預測值。

2 結果

2.1 NIPT 結果 31130 例樣本中檢測成功30927 例,檢測失敗203 例,檢測失敗率為0.65%；檢測成功樣本中共檢出性染色體異常185 例,篩查陽性率為0.60%。

2.2 產前診斷結果 NIPT 提示性染色體異常高風險185例,152例孕婦在本院簽署知情同意書,自愿進行介入性產前診斷羊水穿刺,共檢測出性染色體異常65 例,其中性染色數目異常57 例(含性染色數嵌合10 例),性染色結構異常8 例(合并CNVs 1 例)；25 例孕婦拒絕進一步檢測,8 例失訪。

2.3 NIPT 篩查性染色體異常陽性預測值 65 例性染色體異常孕婦中,核型分析結合FISH 確診32 例,核型分析結合CNVs 確診31 例,行核型分析結合FISH、CNVs 確診2 例,檢出比對不一致6 例。NIPT 檢測45,X、47,XXX、47,XYY、47,XXY 的陽性預測值及性染色體異常總體陽性預測值分別為24.44%、57.14%、75.00%、75.56%、42.76%。見表1,表2。

表1 NIPT 篩查性染色體異常陽性預測值(n,%)

表2 核型分析與CNVs/FISH 結果對比(部分節選)

續表2

3 討論

在NIPT 技術出現前,性染色體非整倍體的確診率低,除產前診斷外,個體的性染色體非整倍體常在青春期后因性發育異常才得以確診。一項基于人口學數據的調查研究顯示,由于NIPT 對性染色體非整倍體的篩查率提高,2016 年性染色體非整倍體產前診斷比例由2010 年的0.95%提高到2.93%［1］。性染色體非整倍體包含Turner 綜合征(45,X)、超雌綜合征(47,XXX)、超雄綜合征(47,XYY)和克氏綜合征(47,XXY)是出生人群中最常見的染色體異常,發生率約占新生兒的1/400～1/350［2］。本研究檢出性染色體非整倍體從多到少依次為47,XXY、47,XYY、47,XXX、45,X。

大量的臨床研究表明,NIPT 篩查胎兒常見染色體非整倍體的特異性和敏感性均高達99%,因此被廣泛用作一線的產前篩查技術。有研究顯示,NIPT 對性染色體非整倍體的陽性預測值為48.4%(根據特定的性染色體三體,其陽性預測值為30%～67%)［3］。本研究對152 例NIPT 提示性染色體異常行產前診斷,確診65 例,總體陽性預測值為42.76%。Petersen 等［4］對712 例無創陽性標本研究顯示,無創檢測性染色體非整倍性的陽性預測值約為 45,X(26%)、47,XXX(50%)及47,XXY(86%)。本研究NIPT 檢測45,X、47,XXX、47,XYY、47,XXY 的陽性預測值及性染色體異常總體陽性預測值分別為24.44%、57.14%、75.00%、75.56%、42.76%。與文獻基本相符,具有臨床意義。

染色體CNVs 是由于基因組的結構變異造成基因質量的改變,導致其表達水平的顯著變化,出現一系列臨床可識別的疾病。NIPT 的無創性可減少孕婦因侵入性診斷導致流產和感染的風險,對于檢測CNVs 方向的價值正在逐漸受到關注,據文獻報道,低覆蓋的常規NIPT 已具備檢測CNVs 的能力,其敏感性和特異性分別為84.2%和98.4%［5］。也有文獻報道,胎兒DNA片段的大小會影響NIPT 的檢測性能,片段越大,檢測性能越好,對于片段＞5 Mb 的CNVs,其敏感性可達90%［5］。本研究確診了5 例CNVs 陽性胎兒(拷貝數片段＞7 Mb 且為致病性變異),孕婦均選擇終止妊娠。

本研究中有6 例性染色體嵌合病例核型分析結果與FISH、CNVs 結果比對不一致。分析原因,FISH 與CNVs 檢測的細胞包含羊水中的活細胞和死細胞,而核型分析的細胞培養則為羊水中的成功貼壁并形成克隆的活細胞,兩種檢測方法所反映的細胞來源群體是不完全一樣的。細胞培養過程也存在對不同細胞的篩選作用,不同核型細胞的生長差異存在較大差別,導致最終的嵌合比例與FISH、CNVs 等利用未培養細胞的結果有差異。并且三者對于低比例嵌合的檢測敏感性也稍有不同。FISH 通常無法準確檢出極低比例(＜10%)嵌合。CNVs 對于嵌合比例≥30%的嵌合體的檢測結果可靠性高。雖然在理想條件下可檢測嵌合比例低至5%的嵌合體,在臨床樣本中也報道可檢出＞10%的染色體非整倍體嵌合,但是其敏感性和特異性受諸多因素影響［6］。

性染色體異常會引起胎兒性器官發育不良,并可伴有其他臟器功能異常和智力低下化、精神障礙等臨床表現［7］。本研究用核型分析方法檢出性染色體結構異常8 例,后經CNVs/FISH 驗證結果分別為psu dic(Y)假雙著絲粒嵌合2 例(病例3、6),idic(Y)等臂雙著絲粒嵌合1 例(病例4),Y 染色體插入伴重復1 例(病例8),環狀X 染色體嵌合1 例(病例5),X 染色體部分缺失3例(病例7、9、10)。以上病例不僅存在復雜的結構異常,部分還存在不同嵌合等現象。此類病例應建議遺傳咨詢并進行核型分析結合CNVs/FISH 檢測。對于Y 染色體結構異常病例,必要情況下還應進行AZF 及SRY 基因檢測,明確診斷。雙著絲粒dic(Y)由于結構不穩定,在細胞分裂過程中易丟失,因此多數文獻報道為合并45X 嵌合體,僅有少量報告為非嵌合個體［8］。

染色體核型分析是診斷染色體異常較為公認的“金標準”,可較為直觀地顯示染色體畸變的結構,發現染色體相互易位、倒位等染色體平衡結構重排［9,10］。但核型分析分辨率較低,對于＜10 Mb 的片段較難發現或確定,不能檢測出基因組功能性的微小結構突變［11,12］。診斷低比例染色體嵌合體在區分真性、假性嵌合過程中仍然存在不足。

FISH 檢測是基于熒光信號進行判斷,只能檢測目標染色體的特定區域,其他染色體數目無法檢測,也無法檢測染色體探針區域以外的片段是否發生了缺失、重復、易位或倒位［9］。而結果中的信號判斷往往受到多個因素的影響,例如背景不干凈時可能出現一些雜信號；兩個染色單體分開時原本靠的很近的兩個信號會分開類似兩個信號等。

CNVs 是一項近年來興起的高通量測序技術,彌補了核型分析染色體結構性變異分辨率的不足。但由于技術局限性,目前尚無法判斷遺傳物質總量不變的情況下染色體結構異常,無法發現染色體相互易位、倒位等染色體平衡結構重排。同理,由于嵌合比例不定,當不同種類核型以不同比例出現嵌合時可能出現不同或相同的比例結果［13-15］。對于由47,XXX 與45,X 兩種性染色體非整倍體構成的嵌合體,若細胞比例各占50%,則會將其判斷為X 染色體拷貝數無異常［11］。如病例1 核型結果為45,X(55%)/47,XXX(45%),CNVs 結果為45,X(20%)/46XX(80%)；病例2 核型結果為47,XXX(90%)/45,X(10%),CNVs 結果為47,XXX(20%)/46,XX(80%)。

本研究中有87 例孕婦的NIPT 結果與產前診斷不符,考慮其原因可能與母體外周血中胎兒游離DNA 濃度、胎盤嵌合、母體染色體異常、母體是否患有腫瘤性疾病、雙胎之一死亡及實驗過程中樣品之間的相互干擾等因素有關。與常染色體非整倍體相比,NIPT 檢測性染色體變異面臨額外的挑戰［16-18］。X 染色體包含較多的GC 堿基對,X 和Y 染色體標記序列的相似性導致定位困難。在胎兒性別未知的情況下,兩條染色體需要同時在母體性染色體的背景下進行評估,容易發生錯誤,因此,將NIPT 技術用于篩查性染色體異常仍需積累更多的數據,改善實驗方案［13］。

綜上所述,盡管NIPT 對于篩查性染色體異常的陽性預測值偏低,但對臨床仍有一定的參考價值,對NIPT 篩查提示性染色體異常高風險,應建議選擇介入性產前診斷進行確診。對于NIPT 提示性染色體異常病例,行核型分析結合FISH、CNVs 技術聯合檢測可彌補單一檢測方法診斷羊水穿刺胎兒染色體嵌合體出現誤診的不足,且有助于發現染色體低比例嵌合及微缺失、微重復,為產前遺傳咨詢提供了更加可靠的實驗室診斷結果。