不同濃度維生素D 刺激下體外滋養細胞的二代測序研究

徐 彤 ，馬巖團進 ，張宇航 ，何秋月 ，黃 薇 ，呂夢欣 ，唐 健 ，何建萍 ，蔣國慶 ，錢 源 1,2,3,4,5,

（1）云南省檢驗醫學重點實驗室，云南 昆明 650032;2）云南省醫學檢驗臨床醫學研究中心，云南昆明 650032;3）昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，云南 昆明 650032;4）昆明市婦幼保健院醫學遺傳與產前診斷中心，云南 昆明 650032;5）昆明市婦幼保健院國家婦產疾病臨床醫學研究中心（云南）聯合重點實驗室，云南 昆明 650032;6）昆明醫科大學第一附屬醫院產科，云南 昆明 650032）

維生素 D 是人體內不可缺少的類固醇激素，也是一種脂溶性維生素，與血管生成、調節組織器官免疫、細胞的凋亡和增殖等方面密切相關[1]。維生素 D 可以在蛻膜和胎盤組織中表達，在整個胚胎發育過程當中起到非常重要的作用[2]。即使維生素 D 在人體生命過程中發揮著十分重要的作用，但維生素 D 在孕婦人群中的缺乏仍是一個普遍現象[3]。有學者評價了來自7 個國家的13 項研究，發現孕婦維生素D 缺乏的患病率在51.3%至100%之間，而亞洲、中東和非洲這些地區的孕婦的維生素D 缺乏患病率在全球范圍內最高，其值高達70%～80%[4]。妊娠與維生素 D 的代謝有著明顯相關性，維生素D 的缺乏與產后抑郁、胎兒骨骼發育、胎兒骨骼發育、早產、流產、妊娠期糖尿病、小于胎齡兒、子癇前期、不孕不育等圍孕期疾病密切相關[5-8]。

在本研究中，筆者通過對維生素 D 刺激后胎盤滋養細胞的RNA 測序分析，尋找DEG，為維生素 D 缺乏引起的不良妊娠結局的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與收集

人胎盤滋養細胞株 HTR-8/SVneo 購自BioVector 質粒載體菌種細胞基因保藏中心。將1，25（OH）2D3粉末用無水乙醇配制成100 μmol/L 的原液，再用1640 培養基分別稀釋成0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L 的稀釋液。將滋養細胞分為 5 組，包括不用維生素 D 刺激的對照組（Control 組）、維生素 D 刺激濃度為0.1 nmol/L組（VitD 0.1 組）、維生素D 刺激濃度為1 nmol/L組（VitD 1 組）、維生素 D 刺激濃度為 10 nmol/L組（VitD 10 組）和維生素 D 刺激濃度為100 nmol/L 組（VitD 100 組）。于37 ℃、5% CO2培養箱中，每2～3 d 對細胞進行傳代培養，取處于對數生長期的細胞進行下一步的刺激實驗。用不同濃度的維生素 D（0.1、1、10、100 nmol/L）刺激細胞，于24 h 后收取并放入-80 ℃冰箱保存，便于細胞的RNA 提取和測序分析。

1.2 總 RNA 提取、質檢和測序分析

建庫起始提取細胞的總 RNA，總量 ＞=1 μg。使 用 Agilent 對 RNA 進行長度檢測，樣品檢測達到合格標準后，構建文庫，Illumina Hiseq 平臺上測序。

1.3 DEG 的篩選

使用R 語言的 limma 包篩選出DEG。設置P值和差異倍數（fold change，FC）進行DEG 的篩選，當P值 ＜ 0.05 和|log2FC| ＞ 1 被認為差異具有統計學意義。使用“Venny”（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制EDG 的交集韋恩圖。

1.4 GO 和 KEGG 對 DEG 進行富集分析

DAVID（http://david.ncifcrf.gov/）在線工具對篩選出的DEG 進行GO 和KEGG 富集分析。

1.5 PPI 網絡構建與中樞基因篩選

利用STRING（https://string-db.org）識別DEG編碼蛋白質之間的相互作用。用Cytoscape 軟件（V.3.8.0）可視化 PPI 網絡，使用CytoHubba 中的對Hub 基因進行排序和評估。

2 結果

2.1 DEG 的篩選結果

分析了4 種不同濃度維生素D 刺激的細胞樣本和未加維生素D 刺激的正常對照樣本的基因表達譜數據（圖2）。通過對表達矩陣數據分析，VitD 0.1 vs Control 組共獲取了 354 個DEG，包括242 個上調，112 個下 調（圖1A）；VitD 1 vs Control組共獲取了 320 個DEG，包括 216 個上調，104個下調（圖1B）；VitD 10 vs Control 組共獲取了374 個DEG，包括 277 個上調，97 個下調（圖1C）；VitD 100 vs Control 組共獲取了 300 個DEG，包括151 個上調，149 個下調（圖1D）。最后對 4 組差異基因數據取交集，共獲得 9 個共同的DEG（圖3，表1）。

表1 共同差異基因表達情況Tab.1 Expression of common DEGs

圖1 滋養細胞差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in trophoblast cells

圖2 滋養細胞基因表達的熱圖Fig.2 Heat map of trophoblast gene expression

圖3 差異表達基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differentially expressed genes

2.2 GO 富集分析

對 4 組DEG 進行GO 的富集分析，包括生物學過程（BP）、細胞組成（CC）、和分子功能（MF）。VitD 0.1 組vs Control 組DEG 顯著富集的 BP 主要包括膠原原纖維組織、細胞分化和趨化作用，CC主要包括膠原三聚體復合物、蛋白質的細胞外基質和膠原蛋白三聚物，MF 主要包括受體配體活動、受體調節器活動和蛋白質橋接（圖4 A）。VitD 1 組vs Control 組DEG 顯著富集的BP 包括蛋白質分泌的正調控和蛋白質分泌等，CC 包括膠原三聚體復合物和膠原蛋白三聚物，MF 主要包括受體調節器活動和細胞因子活性（圖4 B）。VitD10 組vs Control 組DEG 顯著富集的 BP 主要包括細胞分化的負調控、信號受體活性的調節等，CC 主要包括蛋白質的細胞外基質和細胞的頂端部分，MF 主要包括受體配體活動和受體調節器活動（圖4 C）。VitD 100 組vs Control 組DEG 顯著富集的BP 包括細胞外結構組織和細胞外基質的組織，CC 主要包括膠原蛋白三聚物、膠原三聚體復合物和細胞外基質成分，MF 主要包括受體配體活動、受體調節器活動（圖4D）。

圖4 GO 富集分析結果Fig.4 GO enrichment analysis results

2.3 KEGG 通路分析

KEGG 分析顯示VitD 0.1 組 vs Control 組DEG 主要富集于刺激神經組織的受體配體相互作用、細胞粘附分子和胃癌等信號通路（圖5A），VitD 1 組 vs Control 組DEG 主要富集于細胞因子受體相互作用和產生IgA 的腸道免疫網絡等信號通路（圖5 B），VitD10 組 vs Control 組DEG 主要富集于炎癥性腸病和瘧疾等相關信號通路（圖5 C），VitD 100 組 vs Control 組DEG 主要富集于炎癥性腸病、阿米巴病和 PI3K-Akt 信號通路（圖5 D）。

圖5 KEGG 通路分析結果Fig.5 Results of KEGG pathway analysis

2.4 PPI 分析

STRING 分析4 組DEG 構建PPI 網絡，使用Cytoscape 軟件進行網絡可視化，用Cytoscape 軟件中Cytohubba 插件中的 “Degree ”來計算DEG的重要性排名。如 圖6A 和表2 所示VitD 0.1 組vs Control 組DEG 的Degree 排名前5 的分別是COL1A2、ACTA2、S100A4、TAGLN 和CSF1R。如圖6B 和表3 所示VitD 1 組 vs Control 組DEG的Degree 排名前5 的分別是 TLR4、TNFSF13B、FTCD、S100A4 和 APOBEC3G。如圖6C 和表4 所示VitD 10 組 vs Control 組DEG 的Degree 排名前5 的分別是IL6、IGF1、PDGFRB、TGFB2 和BGLAP。如圖6D 和表5 示VitD 100 組 vs Control組DEG 的Degree 排名前5 的分別是TLR4、COL4A4、S100A4、COL8A1 和 COL11A1。

表2 VitD 0.1 vs Control top 前5 的基因Tab.2 VitD 0.1 vs Control Top 5 genes

表3 VitD 1vs Control top 前5 的基因Tab.3 VitD 1 vs Control Top 5 genes

表4 VitD 10 vs Control top 前5 的基因Tab.4 VitD 10 vs Control Top 5 genes

表5 VitD 100 vs Control top 前5 的基因Tab.5 VitD 100 vs Control Top 5 genes

圖6 PPI 網絡互作圖Fig.6 PPI network interworking diagram

3 討論

活性形式的維生素 D 能改善胎盤細胞的功能障礙[9]。隨著對維生素 D 在妊娠過程中作用機制研究的不斷深入，已有研究表明維生素 D 的缺乏與妊娠期的高血壓、糖尿病等不良妊娠結局顯著相關[10]。促炎性細胞因子的高表達會導致不良妊娠結局，維生素 D 可通過抑制核因子-?B 通路信號級聯，下調促炎細胞因子的表達，抑制免疫反應進而改善妊娠結局[11]。有研究表明，維生素 D可以通過抑制胎盤滋養層細胞凋亡從而減少不良妊娠結局的發生[12]。

本研究中，筆者獲得了9 個共同的DEG。其中CYP24A1 在維生素D 降解中具有重要作用，其表達增加可能是維生素 D 缺乏和疾病進展的潛在原因[13]。在多種腫瘤組織中GAS5-AS1 的表達水平明顯低于正常組織，高表達的 GAS5-AS1 能夠抑制多種腫瘤性疾病如宮頸癌、膠質瘤、肝細胞癌和肺癌的生長和轉移[14-17]。PCSK4 基因主要在睪丸生精細胞中轉錄，PCSK4 缺陷小鼠的精子表現出加速獲能、早熟頂體反應、受精能力的受損，它在體內表達量的下降會導致嚴重的雄性不育[18]。這些基因在維生素 D 和不良妊娠結局的研究中尚未見有報道，它們是否是維生素 D 缺乏引起不良妊娠結局的潛在分子標志物，有待進一步的深入研究。對維生素D 在妊娠過程中發揮的作用機制研究具有重要意義。筆者發現不同濃度的維生素D 可能通過作用于不同的信號通路影響著胎盤滋養細胞的遷移和侵襲過程。筆者構建了PPI 網絡，并篩選出5 個關鍵基因編碼蛋白。對該網絡的進一步研究將有利于理解DEG 之間的相互作用，為尋找維生素 D 缺乏引起的不良妊娠結局新的治療靶點提供思路。

已有研究發現，維生素D 缺乏可能通過影響機體炎性因子和脂肪因子水平異常，從而增加肥胖風險，導致糖尿病發生[19].維生素D 可能通過全身炎癥反應的間接途徑從而影響葡萄糖穩態。母體維生素D 缺乏可能會增加機體氧化應激增加促炎反應，從而導致內皮功能障礙[20]，這可能是發生子癇前期的原因之一。有研究發現，維生素D缺乏的患者在補充維生素D 后氧化應激減少[21]。維生素D 的缺乏與NF-KB 信號相關的血管內皮的相關功能抑制增加、細胞炎癥、維生素D 受體和1-a 輕化酶表達減少有關[22]。維生素D 通過減少炎癥細胞因子的產生和作用，從而減少全身炎癥并提高細胞的存活率[23]。而本次研究維生素 D刺激后差異基因主要富集在炎癥信號通路中，這就解釋了維生素D 缺乏可以通過炎癥通路來致病，也可以通過維生素D 來治療炎癥通路影響的相關疾病。

臨床通過檢測血清 25（OH）D 的量來判斷機體是否缺乏維生素 D，＜ 30 ng/mL 為不足，＜ 20 ng/mL即為缺乏，＜ 10 ng/mL 為嚴重缺乏[24]。炎癥性腸病（IBD）是一種慢性炎癥性疾病包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）。已有研究表明，維生素D 缺乏普遍存在于 IBD 患者中，UC 患者為31.6%，而 CD 患者為 38.1%[25]。筆者課題組前期研究表明4 個濃度中10 nmol/L 的濃度最接近人體維生素D 缺乏的生理濃度，而本次研究VitD10 vs Control 組DEG 主要富集在IBD 相關信號通路，這就表明了維生素D 的缺乏，參與了炎癥性腸病的發生和發展過程，有待進一步的實驗研究。

有研究表明，與健康妊娠婦女相比，子癇前期（PE）維生素D 缺乏會導致胎盤miR-21 表達水平升高的現象。筆者課題組在前期研究中發現，用1，25（OH）2D3刺激HTR（人胎盤滋養細胞株HTR-8/SVneo）細胞，1，25（OH）2D3抑制HTR 細胞miR-21 的表達，減弱了miR-21 抑制HTR 細胞侵襲及遷移能力。這可以表明1，25（OH）2D3可能通過減弱PE 患者miR-21 的表達從而影響PE 的病理生理過程，從而改善不良妊娠結局[26]。

綜上所述，本研究通過對維生素 D 刺激后的胎盤滋養細胞進行mRNA 測序分析。篩選出維生素 D 的缺乏在妊娠過程中可能影響的相關基因，并通過生物信息學分析了一些重要基因的功能和參與的信號通路。結果表明維生素 D 的缺乏可能通過相關信號通路里的基因影響胎盤發育和母體健康，進而導致妊娠并發癥的產生。因此，筆者的發現將有助于了解維生素 D 在妊娠并發癥的發病機制中可能的作用，并為維生素 D 缺乏引起的不良妊娠結局的早期診斷、治療和預后提供重要依據。