mTOR 在SD 大鼠TMJOA 髁突軟骨中表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究

王子涵，葉改映，趙 濤，張 俊，胡 瑜

（昆明醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是一種常見的口腔頜面部疾病，臨床癥狀包括顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）區(qū)疼痛，腫脹，張口受限，咀嚼效率低下等，嚴(yán)重影響人類的健康和生活質(zhì)量[1]。TMJOA 是多種致病因素所導(dǎo)致的結(jié)果，目前病因尚不完全清楚。TMJOA 典型病理變化包括髁突軟骨細(xì)胞凋亡，軟骨基質(zhì)降解以及軟骨下骨骨質(zhì)改變等，其中關(guān)節(jié)軟骨的退行性變是OA 病理變化的核心[2]。且在OA 中，自噬在抑制軟骨細(xì)胞凋亡的啟動過程發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[3]。自噬轉(zhuǎn)導(dǎo)信號網(wǎng)絡(luò)及其介導(dǎo)的自噬過程錯綜復(fù)雜，包括P13K/Akt、mTOR、MAPK、和NF—KB 信號通路等[4]。有很多研究證據(jù)表明，使用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑[5]或或 mTOR 基因特異性敲除[6]的動物模型中，OA 的病程明顯減輕，這也使得通過調(diào)控mTOR 來治療TMJOA 成為一個重要的研究方向。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建偏側(cè)咀嚼導(dǎo)致的大鼠TMJOA 動物模型，進(jìn)一步檢測mTOR 在髁突軟骨中的表達(dá)，探討自噬對TMJOA 病程的影響，加深理解TMJOA 的發(fā)生、發(fā)展，對探索相應(yīng)的治療方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物8 周齡清潔級實(shí)驗(yàn)動物（sprague dawley，SD）大鼠購于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[合格證編號：SCXK（滇）K2020-0004]，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)SPF 動物實(shí)驗(yàn)中心，體重（250±25）g，普通清潔環(huán)境，自由活動，給予足量食物和水。

1.1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備正畸絲（杭州西湖材料有限公司，浙江）；蘇木素染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，廣東）；改良番紅O-固綠軟骨染色液（索萊寶，北京）；兔抗SOX9（SRY-related high mobility group-box gene9）抗體（正能生物380995）；兔抗mTOR 抗體（ORIGENE TA325696）；DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，福建）；石蠟切片機(jī)（Leica，德國）；光學(xué)顯微鏡（CARL ZEIS，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及建模方法

1.2.1 動物選擇及分組選用45 只無明顯口腔頜面部疾病的8 周齡健康雄性SD 大鼠。將27 只大鼠按偏側(cè)咀嚼2、4、8 周隨機(jī)分為3 個組，每組9 只；同時設(shè)立相應(yīng)假手術(shù)對照組，每組6 只。

1.2.2 建模方法大鼠于手術(shù)前夜禁食禁水，提前一天配置好3%戊巴比妥備用。手術(shù)時按每只大鼠1.5 mL 麻醉量進(jìn)行麻醉，麻醉起效后，固定大鼠，并牽拉上下頜切牙及舌頭以暴露下頜牙列，固定其開口狀態(tài)。用持針器持一段長2 cm 的正畸絲從右側(cè)下頜第一磨牙近中舌側(cè)牙間隙穿入，纏繞牙頸部一圈，并在舌面將兩頭正畸絲纏繞打結(jié)固定。實(shí)驗(yàn)組將正畸絲結(jié)彎曲至牙合面并保留一定長度以造成咬合障礙；對照組將正畸絲彎曲至于鄰牙舌面頸部貼合，無咬合障礙，后用探針檢查穩(wěn)定情況。實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)耳朵減去小三角瓣作為標(biāo)記，對照組不做標(biāo)記。建模后，定期檢查正畸絲的穩(wěn)固情況和完整度。

1.2.3 取材、脫鈣、脫水及包埋建模后2、4、8周分別取材，用脫頸椎處死法處死大鼠，完整切取大鼠右側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)髁突組織，用生理鹽水沖凈后以4%多聚甲醛固定液固定于標(biāo)記好的EP 管中，固定48 h 后將標(biāo)本放入組織標(biāo)本盒中，自來水沖洗過夜。沖洗后用快速脫鈣液進(jìn)行脫鈣，每四小時檢查一次脫鈣程度，待完全脫鈣后流水沖流過夜。將沖洗好的的髁突組織依照70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡6 min 以脫水，再浸泡入二甲苯Ⅰ30 min、二甲苯Ⅱ15 min 以透明。脫水完畢后將髁突組織取出，依次放入60 ℃恒溫烘箱中的熔融石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各60 min（浸蠟時間隨大鼠周齡增加可適當(dāng)延長）。將浸好蠟的組織容納盒放入包埋機(jī)蠟池中，用鑷子將髁突組織平放于金屬包埋盒底，滴滿石蠟，蓋上塑料包埋框盒，標(biāo)號序列放于冷凍機(jī)上冷凍。待石蠟完全凝固后除去多余部分。

1.2.4 組織化學(xué)染色進(jìn)行病理學(xué)檢查組織蠟塊修整后常規(guī)切片、脫蠟、水化后行蘇木素-伊紅和番紅-固綠染色。應(yīng)用改良Mankind 評分和國際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會（OARSI）評分評估大鼠TMJ軟骨病損程度。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色法測定髁突軟骨細(xì)胞中SOX9 及mTOR 的表達(dá)組織蠟塊修整后常規(guī)切片、脫蠟、水化后，通過ABC 法進(jìn)行染色。SOX9 染色一抗為兔抗SOX9（稀釋1∶200），mTOR 染色一抗為兔抗mTOR（稀釋1∶100），所有切片用兔生物素化的二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。固定封片后用光學(xué)顯微鏡拍攝，應(yīng)用imageproplus 選取3 個樣本計算軟骨細(xì)胞的平均光密度值（AOD 值），其平均值作為該組的平均光密度值。所有切片放在相同的載玻片上，在相同條件下共同進(jìn)行處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 Graphpad Prism9.0 統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖統(tǒng)計學(xué)分析。采用完全隨機(jī)設(shè)計的方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髁突軟骨形態(tài)

蘇木精-伊紅（HE）染色顯示，髁突的軟骨結(jié)構(gòu)由內(nèi)向外可依次分為鈣化軟骨層、肥大層、增殖層和纖維層。番紅O-固綠染色顯示，對照組大鼠的髁突軟骨結(jié)構(gòu)層次清晰，表面平整，蛋白多糖分布均勻。

隨著時間推移，實(shí)驗(yàn)組（TMD 組）大鼠的髁突軟骨結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的退行性病變。實(shí)驗(yàn)2 周組HE 染色顯示軟骨組織表面略不均勻；番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖非均質(zhì)性染色。實(shí)驗(yàn)4 周組HE 染色顯示軟骨組織表面不均勻?qū)蛹八搅严叮浌菍幼儽。蚀髮蛹?xì)胞減少，部分標(biāo)本出現(xiàn)表層纖維化和無細(xì)胞區(qū)。番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖染色進(jìn)一步丟失，番紅O 淡染。實(shí)驗(yàn)8 周組軟骨組織表面粗糙，裂隙增大，軟骨細(xì)胞排列紊亂，可見無細(xì)胞區(qū)。番紅O-固綠染色顯示蛋白多糖非均質(zhì)性染色，表層和中深層失染（圖1、2）。改良Mankin 評分[7]和OARSI 評分[8]結(jié)果顯示，對比對照組，實(shí)驗(yàn)組（TMD 組）評分明顯升高（P＜0.05），且病損評分在4 周時最高，8 周略有回落（圖3）。

圖1 大鼠顳下頜關(guān)節(jié) HE 染色（50×）Fig.1 HE staining of TMJ in rats（50×）

圖2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)番紅-固綠染色（50×）Fig.2 HE staining of TMJ in rats（50×）

圖3 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評分Fig.3 Histopathological scores of TMJ in rats

2.2 髁突軟骨中蛋白質(zhì)SOX9 和mTOR 的表達(dá)

SOX9 作為軟骨細(xì)胞增殖、分化的重要調(diào)控因子，其表達(dá)水平反映了顳下頜關(guān)節(jié)的生長改建情況，免疫組織化學(xué)染色顯示SOX9 陽性細(xì)胞主要在細(xì)胞核呈棕色染色（圖4）。實(shí)驗(yàn)過程中隨著異常生物力學(xué)刺激的增加，實(shí)驗(yàn)2 周（P＜ 0.01）、4 周（P＜ 0.05）、8 周（P＜ 0.05）組大鼠髁突軟骨中SOX9 表達(dá)水平呈依次下降且均低于對照組的趨勢（圖5）。

圖4 SOX9 免疫組化染色（100×）Fig.4 Immunohistochemical staining of SOX9（100×）

圖5 mTOR 免疫組化染色（100×）Fig.5 Immunohistochemical staining of mTOR（100×）

mTOR 作為髁突軟骨細(xì)胞的自噬抑制因子，在顳下頜骨關(guān)節(jié)炎中影響細(xì)胞的自噬凋亡，免疫組織化學(xué)染色顯示mTOR 陽性細(xì)胞主要在細(xì)胞質(zhì)呈棕色染色。實(shí)驗(yàn)過程中隨著骨關(guān)節(jié)炎病情發(fā)展，實(shí)驗(yàn)組mTOR 表達(dá)水平呈2 周（P＜ 0.01）、4 周（P＜0.001）下調(diào)，8 周（P＜ 0.05）上調(diào)的趨勢（圖6）。

圖6 SOX9 和mTOR 免疫組化染色強(qiáng)度分析Fig.6 Immunohistochemical staining intensity of SOX9 and mTOR

3 討論

雖然TMJOA 具體病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但研究表明過度的機(jī)械負(fù)荷可能是影響OA 發(fā)生發(fā)展的重要因素[9]，因此偏側(cè)咀嚼常被用于制作一種廉價、高效、貼近于實(shí)際病理環(huán)境的小鼠顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型[10]。在本研究構(gòu)建的大鼠TMJOA 模型中，通過對髁突組織進(jìn)行HE 染色和番紅固綠染色可見軟骨組織表層不平整，出現(xiàn)裂隙；軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞層次紊亂，部分標(biāo)本出現(xiàn)表層纖維化和無細(xì)胞區(qū)；蛋白多糖非均質(zhì)性染色，表層和中深層失染，提示使用偏側(cè)咀嚼構(gòu)建SD 大鼠TMJOA 模型的方法得以成立。另外，在本研究中，通過對髁突組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色可以觀察到，實(shí)驗(yàn)2、4、8 周組大鼠髁突軟骨中SOX9 表達(dá)水平依次下降且均低于對照組，進(jìn)一步顯示了實(shí)驗(yàn)組大鼠骨關(guān)節(jié)炎的炎癥加重情況。

目前的研究認(rèn)為，骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡的增加在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中居于中心地位和始動環(huán)節(jié)[11]。自噬在抑制軟骨細(xì)胞凋亡的啟動過程中，發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞器受損時，自噬被激活，從而清除受損細(xì)胞器，抑制凋亡、促進(jìn)修復(fù)，延緩OA 的病程[12]。

研究表明，在OA 病程中尤其是發(fā)病的早期階段，軟骨細(xì)胞的自噬水平（特別是淺層軟骨）是明顯增高的，并且通過對凋亡及活性氧的調(diào)控影響OA 相關(guān)基因的表達(dá)[13]，Bouderlique T 等[14]使用Atg5cKO 鼠研究增齡性和創(chuàng)傷性O(shè)A 時，發(fā)現(xiàn)抑制軟骨細(xì)胞的自噬可以使凋亡增加，加速增齡性O(shè)A 的進(jìn)程。Zhang M 等[3]通過改變機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的退變，發(fā)現(xiàn)自噬增強(qiáng)，mTOR 和MAP4K3 活性受抑制而降低。表明在OA 中自噬在抑制軟骨細(xì)胞凋亡的啟動過程發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 是一種自噬重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，軟骨的生長發(fā)育以及 OA 的病程均與mTOR 介導(dǎo)的信號通路密切相關(guān)。有很多研究證據(jù)表明，在使用 mTOR 抑制劑[5]或特異性敲除mTOR 基因[6]的動物模型中，OA 的嚴(yán)重程度顯著降低。在筆者構(gòu)建的大鼠TMJOA 早期模型（2W）中，也可以觀察到mTOR 的表達(dá)受到了抑制，提示了在TMJOA 早期，自噬程序被激活而凋亡程序受到抑制，減少了早期炎癥造成的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨損失。

但隨著炎癥的進(jìn)展，建模4 周時mTOR 明顯下調(diào)，而改良Mankin 和OARSI 評分顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組（TMD 組）評分明顯升高，且病損評分在此時達(dá)到最高，這可能是由于短暫增加的自噬是對細(xì)胞應(yīng)激的一種補(bǔ)償反應(yīng)，但當(dāng)長期應(yīng)激超過該機(jī)制的能力時，就造成了嚴(yán)重的損傷[15]。

建模8 周后，mTOR 的表達(dá)又有回升的趨勢，這提示炎癥晚期，自噬受到抑制，而細(xì)胞的凋亡程序被激活，軟骨損失進(jìn)一步加劇。

綜上所述，在筆者構(gòu)建的TMJOA 大鼠模型中，炎癥早期，大鼠的mTOR 表達(dá)受到抑制，軟骨細(xì)胞的自噬被激活而凋亡受到抑制，促進(jìn)退變軟骨修復(fù)，從而延緩了OA 的病理進(jìn)程；但是到了炎癥晚期，mTOR 的表達(dá)被激活，軟骨細(xì)胞的自噬受到了抑制而逐漸向凋亡轉(zhuǎn)化，軟骨損失加重。mTOR 信號在生物力學(xué)誘導(dǎo)的TMJ OA 進(jìn)展中，在將保護(hù)性自噬轉(zhuǎn)變?yōu)槠茐男缘牡蛲鲋邪l(fā)揮了關(guān)鍵作用。

研究表明，僅是通過降解細(xì)胞外基質(zhì)或抑制促炎因子往往不能減緩OA 的進(jìn)程，但通過調(diào)節(jié)自噬，則可以改變軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，從而阻止細(xì)胞凋亡[16]。抑制mTOR 的表達(dá)，則可以激活軟骨細(xì)胞的自噬，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療 OA 的目的[6]。這也使得將 mTOR 作為TMJOA 的治療靶點(diǎn)成為一種有價值的研究方向。本實(shí)驗(yàn)初步探討了機(jī)械應(yīng)力造成TMJOA 后髁突軟骨細(xì)胞的病理特征和mTOR 的表達(dá)變化，為以后靶向藥物的研發(fā)提供一定的參考。