燈盞花素調控急性肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 的mRNA 及蛋白水平

李振坤 ，白團麗 ，楊璘宇 ，王 穎

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，云南 昆明 650101;2）昆明醫科大學第二臨床醫學院，云南 昆明 650500）

肺栓塞（pulmonary embolism）是一種常見且可能致命的肺血管疾病[1]，尋找新的藥物一直是臨床研究熱點。急性右心衰竭是肺栓塞患者主要死亡原因，右心的炎癥因子改變在肺栓塞發病中非常重要，可以作為肺栓塞的發生、發展及預后評估指標[2]。肺栓塞與中性粒細胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractants，CINC）相關的炎癥效應密切相關[3-4]，中性粒細胞相關的炎癥在肺栓塞后的多種并發癥中發揮作用。燈盞花素廣泛用作治療心血管疾病，具有強大的心血管藥理作用。多項藥理研究表明，燈盞花素對缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用[5-6]。本課題前期研究顯示：燈盞花素有抗急性肺栓塞的作用，燈盞花素可以下調肺組織單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant-1，MCP-1）、白細胞介素-13（interleukins-13，IL-13）基因、蛋白水平發揮肺栓塞保護作用[7]，但燈盞花素對右心的炎癥因子影響如何還不得而知。本研究擬通過大鼠肺栓塞模型評估燈盞花對其右心室的保護作用，并通過檢測右心室 CINC-1、CINC-2 基因及蛋白表達水平，驗證燈盞花對肺栓塞后右心室炎癥損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

燈盞花素購自廣東彼迪藥業有限公司（批號：20180101）；醫用低分子肝素購自河北常山生化藥業股份有限公司（批號：F402180807）；PCR 引物設計：Beacon Designer 7.90；引物合成：廣州invitrogen Trizol Reagent：Lifetech 15 596026；WB試劑：RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（6X）均購自碧云天，內參一抗：β-actin 抗體購自 abcam 生物醫藥公司，CINC1 抗體批號 ab86436、CINC2 抗體批號ab 220431；檢測二抗：山羊抗小鼠（HRP 標記）通用型二抗，購自美國 CST 公司，批號 cst 7074，7076。

1.2 動物

SD 雄性大鼠30 只，周齡7～9 周，體重250～300 g，購自昆明醫科大學，許可證號：SCXK（滇）K2015-0002，標準喂養室 溫 20 ℃，濕度 60%。本研究符合昆明醫科大學實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準 。

1.3 儀器

上海UNICO 全波長分光光度計；Thermo 酶標儀；ABI StepOne 定量PCR 儀；BIO-RAD 凝膠成像儀；BIO-RAD 垂直電泳槽；BIO-RAD 濕式轉膜槽；威恒電子天平；其林貝爾靜音混合儀。

1.4 方法

1.4.1 制備自體血栓每組大鼠標記稱重并記錄，大鼠尾靜脈取血 600 μL，立馬注入外徑 1 mm 導管，37 ℃溫箱進行孵育 30 min，放入-20 ℃冰箱中 1 min，進行血栓凝固，30 min 后將導管置入 70 ℃水浴鍋 10 min。取出導管并將導管用刀片切成 2 mm 長度，顯微鑷取出血栓，放入裝有0.002 L 生理鹽水離心管中，制備自體靜脈血栓。

1.4.2 肺栓塞模型建立及給藥處理（1）SD 大鼠隨機分為 5 組（每組6只）：假手術組（Control），模型組（Model），燈盞花素低劑量組（Bre10 g/L），燈盞花素高劑量組（Bre 20 g/L），低分子肝素陽性藥組（LMWH 10.250 IU/L），使用小動物生理儀監測大鼠的心率與呼吸次數。（2）造模 用 2% 戊巴比妥鈉進行動物麻醉后，所有組均沿頸前正中線做長約 2 cm 的切口，鈍性分離大鼠右側的頸總靜脈，并用導管將混有自體血栓 20 個栓子的0.002 L生理鹽水注入到頸總靜脈，縫合切口。假手術組：右側頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水；模型組及給藥各組：右側頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水+血栓塊（20 個）。（3）給藥處理 經大鼠肺栓塞燈盞花素量效實驗確定燈盞花素最佳低、高劑量分別為10 g/L 及20 g/L（表1），于建立模型前 2 h，假手術組與模型組腹腔注射0.002 L 生理鹽水，燈盞花素低劑量、高劑量與低分子肝素陽性藥組腹腔分別注射低劑量燈盞花素（10 g/L）、高劑量燈盞花素（20 g/L）及低分子肝素（10.250 IU/L）。血栓輸注 24 h 后，再次記錄大鼠的心率與呼吸次數，觀察大鼠一般情況。打開腹腔切斷下腔動靜脈放血處死動物，取右下肺組織 HE 染色；右心室組織放入 0.001 L trizol 裂解液（-80 ℃保存），后期進行 Q-PCR 及 WB。

表1 燈盞花素對大鼠肺栓塞影響的量效關系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

表1 燈盞花素對大鼠肺栓塞影響的量效關系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

與假手術組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

1.4.3 HE 染色右下肺組織放入 50 mL 4% 多聚甲醛（常溫固定備用），脫水包埋制備切片，經蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下觀察肺組織的病理變化，普通光學顯微鏡下觀察顯色結果并分別在4 倍鏡、10 倍鏡下拍照。每組6例大鼠，每張切片隨機選5 個高倍視野。

1.4.4 Q-PCR 檢測mRNA 表達Q-PCR 引物序列如下（F 代表上游引物forward；R 代表下游引物reverse），見表2。

表2 Q-PCR 引物序列Tab.2 Q-PCR primer sequences

取20 mg 大鼠右心室組織，液氮研磨后，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應體積為20 μL，42 ℃ 溫育60 min，70 ℃ 加熱10 min 后終止反應，冰浴冷卻，得到逆轉錄的cDNA 第一條鏈。進行Q-PCR 擴增，放入ABI Stepone 儀器中。

設置PCR 循環反應條件，預變性，變性（95 ℃）15 s，退火及延伸（60 ℃）30 s，共40～45 循環，對循環產物進行溶解曲線分析，反應結束，收集信息，做Ct 值分析。Q-PCR 的實驗結果采用2-△△Ct法進行分析，＞ 1，參考公式2-△△Ct==2^-[（Ct 實驗組目的基因-Ct 實驗組內參基因）-（Ct 對照組目的基因-Ct 對照組內參基因）]，得到Ct 數據后再與內參作除法比較。

1.5 Western-blot 檢測蛋白表達

取-80 ℃ 的肺栓塞大鼠左下肺，每100 mg組織中加入500 μL 的RIPA 裂解液（含50 μL 蛋白酶抑制劑），剪碎組織后，冰浴環境下用超聲細胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解 20 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，根據BCA 試劑盒測定蛋白濃度。10% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入蛋白樣品 50 μg，進行電泳；然后進行濕轉轉膜（260 mA 轉膜 70 min 至PVDF 膜上）；5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；特異性一抗（1∶1 000）封閉 4 ℃ 過夜，TBST 洗膜3 次；二抗IgG-HRP（1∶5 000）室溫封閉 1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min。將 PVDF 膜置于化學發光成像儀進行成像，采用 Image Lab 分析軟件對各組條帶的光密度值進行分析。

1.6 統計學處理

研究數據采用SPSS 18.0 統計學軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，多組間的比較使用單因素方差分析（One-way ANOVAs），統計結果采用Graphpad Prism 8.0 作柱狀圖，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況，生命體征情況

模型組大鼠心率、呼吸次數增快、面色青紫，各組分別給與燈盞花素低、高劑量及低分子肝素后有所改善。心率監測顯示：假手術組（356±14）次/min，模型組（428±31）次/min，燈盞花素低劑量組（374±25）次/min，燈盞花素高劑量組（357±19）次/min，低分子肝素組（385±33）次/min。模型組大鼠與與假手術組相比，模型組心率增快有明顯統計學意義（t=5.15，P＜ 0.01）；燈盞花素低劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統計學意義（t=3.30，P＜ 0.01）；燈盞花素高劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統計學意義（t=4.75，P＜ 0.01）；低分子肝素組與模型組比較，心率下降有明顯統計學意義（t=2.30，P＜ 0.01），見表3，圖1。

表3 燈盞花素對大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

表3 燈盞花素對大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

與假手術組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

圖1 給藥后大鼠心率、呼吸變化Fig.1 Changes in heart rate and respiration in rats after administration

呼吸監測顯示：假手術組呼吸（82±9）次/min，模型組（94±9）次/min，燈盞花素低劑量組（76±37）次/min，燈盞花素高劑量組（84±10）次/min，低分子肝素組（83±7）次/分。模型組大鼠與與假手術組比較，模型組呼吸增快有統計學意義（t=2.44，P＜ 0.05）；低分子肝素組與模型組比較，呼吸下降有統計學意義（t=2.34，P＜ 0.05），見表3，圖1。

2.2 病理學改變

HE 染色肺組織病理的變化顯示：假手術組肺動脈內干凈無血栓，模型組肺小動脈內血管內多發血栓，肺動脈內血管內間質炎癥反應明顯，肺泡內紅色炎癥樣物質滲出，右心室擴張，可確定肺栓塞模型組大鼠上述指標相比正常組有損傷，造模成功。分別給予高、低劑量燈盞花素后，上述病理改變分別在4 倍鏡、10 倍鏡下好轉，肺血管內多發血栓減輕、間質炎癥反應減輕、肺泡內紅色炎癥樣物質減少，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理檢查Fig.2 Pathological examination of lung tissue of rats in each group

2.3 Q-PCR 顯示基因水平改變

各組右心室Q-PCR 結果：CINC-1 的溶解曲線Ct 值與內參比值顯示假手術組（1.19±0.18），模型組（15.11±2.35），燈盞花素低劑量組（7.40±1.50），燈盞花素高劑量組（2.27±0.45），低分子肝素組（3.20±0.58）。與假手術組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統計學意義（t=14.46，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=6.77，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=13.13，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差異具有統計學意義（t=3.06，P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Q-PCR 檢測燈盞花素干預肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 基因表達Fig.3 Q-PCR detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 gene expression in rats with breviscapine intervention with pulmonary embolism

各組右心室Q-PCR 結果：CINC-2 的溶解曲線Ct 值與內參比值顯示假手術組1.27±0.26，模型組11.89±1.82，燈盞花素低劑量組6.12±1.11，燈盞花素高劑量組2.63±0.94，低分子肝素組3.41±0.92。與假手術組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統計學意義（t=14.14，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=6.62，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=11.06，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值沒有統計學意義（t=1.45，P＞ 0.05），見圖3。

2.4 Western-blot 顯示蛋白表達水平改變

各組右心室CINC-1 的Western-blot 結果：CINC-1 蛋白表達水平與內參比值顯示假手術組（0.393±0.168），模型組（0.879±0.132），燈盞花素低劑量組（0.616±0.145），燈盞花素高劑量組0.411±0.74，低分子肝素組0.576±0.138。與假手術組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統計學意義（t=5.57，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=3.29，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=7.58，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有統計學意義（t=2.58，P＜ 0.05），見圖4，圖5。

圖4 WB 檢測肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達Fig.4 The protein expression of CINC-1 and CINC-2 in the right ventricle of rats with pulmonary embolism detected by WB

各組右心室 CINC-2 的 Western-blot 結果：CINC-2 蛋白表達水平與內參比值顯示假手術組0.462±0.229，模型組 0.934±0.250，燈盞花素低劑量組0.730±0.220，燈盞花素高劑量組 0.506±0.171，低分子肝素組 0.677±0.199。與假手術組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統計學意義（t=3.41，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統計學意義（t=3.47，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值差別無統計學意義（t=1.50，P＞ 0.05）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值差別無統計學意義（t=1.60，P＞ 0.05），見圖4，圖5。

圖5 WB 檢測燈盞花素干預肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達Fig.5 WB detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 protein expression in rats with breviscapine intervention withpulmonary embolism

3 討論

隨著各地診斷水平的提高，肺栓塞被越來越多的重視，每年的肺栓塞確診病例不斷增加。在美國，每年診治超過 600 000 例 急性肺栓塞病例，肺栓塞是急診科的常見疾病[8]。來自發達國家的一項十年的研究顯示：肺栓塞和深靜脈血栓的在癌癥患者中高發，而且發生肺栓塞后死亡風險極高[9]。肺栓塞危害極大，常常引起急性右心衰竭、呼吸衰竭、呼吸困難、胸痛甚至猝死等嚴重并發癥。基于western-blot 和蛋白組學的研究，肺栓塞導致肺動脈高壓和肺部損傷，激活炎癥系統，導致肺部、右心多種炎癥微蛋白表達差異，炎癥因子可以作為肺栓塞很好的評估指標。肺栓塞的治療一直是臨床棘手的問題，主要的治療方案包括抗凝和溶栓藥物治療，但是核心的抗凝藥物肝素可能誘導血小板減少癥、致命性出血、截肢，急性心肌梗塞和中風等致命的并發癥[10]，而溶栓治療大規模 meta 分析甚至顯示其導致的主要器官出血率高達 6%，顱內出血率高達 2%[11]。新的治療肺栓塞的藥物開發很有必要。

CINC 系列因子包括中 CINC-1、CINC-2（α、β）等，在嗜中性粒細胞浸潤的炎癥中扮演重要角色[12]。Watts 等[13]報道肺栓塞使中性粒細胞右心導致功能障礙，CINC-1、CINC-2 的巨噬細胞聚集在右心衰肌細胞損傷的心臟地區，電子顯微鏡顯示肌細胞壞死和炎癥細胞的吞噬作用，CINC系列炎癥因子可以作為肺栓塞評估指標。本研究顯示：肺栓塞模型組大鼠心率、呼吸有增快，差別具有統計學意義，病理示大鼠肺組織內見動脈血栓、右心室擴張，提示肺栓塞可以導致右心衰，誘發大鼠生命體征惡化。Q-PCR、WB 顯示模型組大鼠右心室心肌 CINC1 及CINC-2 基因、蛋白水平明顯升高，結果有明顯統計學差異（P＜ 0.01），可能的機制為急性肺栓塞廣泛堵塞下游肺血管床，誘發肺動脈高壓及急性右心衰相關炎癥反應，而急性右心衰繼發右心室明顯增大、擴張、炎癥反應，增加了炎癥因子 CINC-1 及 CINC-2 水平。

燈盞花素對缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用。也有較強的抗炎效應。燈盞花素還有有抗急性肺栓塞的作用，HU 等在大鼠急性肺栓塞模型中證實了燈盞花素對肺栓塞動物動脈血氣的氧分壓、二氧化碳分壓水平異常具有改善作用，但具體機制及藥物作用的靶點未明確[14]。本課題前期研究顯示燈盞花素有肺內抗肺栓塞作用[7]，但對肺栓塞繼發右心損傷的炎癥機制未知。本研究顯示燈盞花素高、低劑量組及低分子肝素組均能改善肺栓塞大鼠心率、呼吸次數及顯著下調明顯升高的 CINC-1 及 CINC-2 基因和蛋白水平，提示燈盞花素具有改善肺栓塞后大鼠心率及呼吸增快的效應，CINC-1 及 CINC-2 可能作為燈盞花素發揮抗肺栓塞炎癥作用的新靶點。另外，在大鼠右心 CINC-1 基因和蛋白表達水平上，燈盞花素高劑量組優于陽性藥低分子肝素組和燈盞花素低劑量組，燈盞花素具有劑量相關性。這一結果證實了燈盞花素在肺栓塞大鼠模型中具有改善右心室中性粒細胞驅化因子的作用可能優于低分子肝素。

燈盞花素可以下調急性肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 的基因和蛋白表達水平，可能發揮抗肺栓塞炎癥的作用。