禽腺病毒4型湖北株的分離鑒定及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表達

李 劍， 徐鵬飛， 葉十一， 陳紅心， 周啟立， 翁長江， 熊 濤

(1.長江大學生命科學學院，湖北荊州 434000； 2.大北農集團湖北分公司，湖北武漢 430000；3.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江哈爾濱 150069)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)是一種直徑為60～90 nm的無囊膜雙股DNA病毒，分為3個群，Ⅰ群又分為A～E 5個種，12個血清型[1-2]。其中，禽腺病毒4型(FAdV-4)是引起雞肝炎-心包積液綜合征的病原體，1987年該病首次被發現于巴基斯坦的安卡拉，隨后在北美洲、南美洲和亞洲等地傳播[3-4]。2015年6月以來在我國多個省份呈爆發式傳播，病死率高達80%，給我國養禽業造成了極大的損害[5]。其中，以山東、山西、廣西和江蘇等地的毒株報道[6-10]最多，而湖北地區的毒株鮮有報道。所以，研究湖北地區禽腺病毒4型流行病學和遺傳進化尤為重要。禽腺病毒的衣殼蛋白有Hexon、Penton和Fiber 3種主要結構蛋白。其中，Hexon是衣殼含量最高的蛋白，攜帶主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，基因序列較為保守，能用于禽腺病毒的進化分析和類型區分[11]。Fiber分為Fiber1和Fiber2 2條蛋白，Fiber2長度比Fiber1短，且Fiber2比Fiber1蛋白活性更好[12]。Fiber2蛋白具有型和亞群特異性抗原決定簇，能夠識別宿主細胞的特異受體并與受體相結合，從而介導病毒的感染，誘導機體產生病毒特異性中和抗體，在免疫反應方面起重要的作用[13-14]。因此，Fiber2蛋白可作為基因工程亞單位疫苗的候選者。田開月等成功在大腸桿菌中表達了禽腺病毒4型的Fiber2蛋白，而國內學者對禽腺病毒4型的Fiber2蛋白在乳酸菌中表達研究較少[15]。本研究將采集于湖北省某養雞場的病變組織樣處理后接種雞肝癌細胞(LMH)，分離出2株禽腺病毒，對其進行PCR鑒定和Hexon基因測序分析，并根據Hexon基因序列分析結果研究其遺傳進化關系，并以其基因組DNA為模板擴增出Fiber2基因，構建乳酸菌重組表達系統，并對Fiber2蛋白進行表達，以期為禽腺病毒4型口服疫苗的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及病料

細胞：LMH購自美國生物資源中心(ATCC)，由本實驗室傳代凍存。

病料：病死雞肝臟等病變組織樣，2020年9月10日無菌采集于湖北省荊州市某養雞場，凍存備用。

1.2 引物合成及測序

引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 主要試劑

Waymouth’s MB 752/1培養基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗、Gelatin，均購自Gibco公司；病毒基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-18T 載體、HindⅢ和XbaⅠ限制酶，均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；pNZ 8148-MC 1061、MC 1061、NZ 9000菌種，均購自上海瑞楚生物科技有限公司；乳酸鏈球菌素(Nisin)，購自北京酷來搏科技有限公司；NC膜，購自北京欣華綠源科技有限公司；HRP標記的羊抗鼠 IgG、小鼠抗 6His-tag 單克隆抗體，均購自Proteintech公司；Omni-ECL 基礎型化學發光檢測試劑盒，購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。

1.4 病料的處理

2020年9月13日于長江大學生命科學學院生物安全實驗室取收集到的病變組織按1 g ∶10 mL加入PBS緩沖液研磨，反復凍融3次，8 000 r/min離心20 min后取上清。過濾除菌后按1 ∶1 000體積比加入青-鏈霉素雙抗，-80 ℃保存待用。

1.5 病毒的分離

LMH細胞進行傳代培養后，待LMH細胞長滿80%時，棄去培養液并用PBS緩沖液洗2次，將待用病毒懸液按1 ∶10體積比接入LMH細胞，37 ℃孵育60 min，然后加入含1%胎牛血清的培養液，同時設正常的細胞陰性對照，37 ℃、5% CO2培養箱培養3～5 d。每日觀察LMH細胞的病變情況，待LMH細胞出現80%病變反復凍融3次后，6 000 r/min 離心15 min收集病毒上清，-80 ℃保存。按照上述方法將病毒懸液盲傳3代。

1.6 PCR檢測

參考GenBank中登錄的FAdV-4的Hexon基因序列(登錄號為MK650194.1)，采用Primer Premier 5.0設計1對特異性鑒定引物：FAdV4-F：5′-C A A C T A C A T C G G G T T C A G G G-3′，FAdV-R：5′-G G T G G C G T T T C T C A G C A T-3′，擴增片段長度為958 bp。采用病毒基因組DNA提取試劑盒提取第4代病毒懸液的基因組DNA，并以其為模板進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 病毒含量測定

采用1%胎牛血清的細胞培養液對病毒懸液進行10倍倍比稀釋，取長滿80% LMH細胞的96孔板，棄去培養液并用PBS緩沖液洗2次，然后每孔接入 100 μL 病毒稀釋液，每個稀釋度8孔，并設立正常細胞陰性對照。37 ℃孵育60 min，再加入1%胎牛血清的細胞培養液，37 ℃、5% CO2培養箱培養3～5 d。每日觀察并記錄病變情況，并用Reed-Muench法計算病毒含量。

1.8 Hexon基因的擴增及測序

參考GenBank中登錄的FAdV-4的全基因組序列(登錄號為MG856954.1)，采用Primer Premier 5.0設計了覆蓋Hexon基因全部序列的引物：Hexon-F：5′-G T A T G T A T G T C G C G T T T C G-3′，Hexon-R：5′-G C A T C G C G T C G T A T T T A A-3′，擴增片段長度為3 144 bp。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經電泳檢測并回收。回收產物連接至pMD18-T載體，然后轉化至DH5α感受態細胞。挑取單菌落振蕩培養后用菌液進行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌液送公司測序。

1.9 Hexon基因的遺傳進化分析

將測序結果用DNAstar 7.1.0中的SeqMan進行拼接，得到的Hexon基因序列與GenBank數據庫中的FAdV參考毒株進行BLAST比對，并使用MAGE X構建遺傳進化樹。

1.10 Fiber2基因的克隆

參考GenBank中登錄的FAdV-4的Fiber2基因序列(登錄號為HQ709232.1)設計擴增Fiber2基因的引物，并插入酶切位點，6×His標簽和保護堿基，Fiber2-F：A T A T C T A G A A T G C T C C G G G C C C C T A A，Fiber2-R：C G C A A G C T T A T G A T G A T G A T G A T G A T G T T A C G G G A C G G A G G C，擴增片段長度為1 440 bp。以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物電泳檢測并回收。回收產物經限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切，并對酶切產物進行回收。

1.11 重組表達載體的構建

pNZ8148載體經限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切后，對酶切產物進行回收。pNZ8148載體酶切產物和Fiber2基因酶切產物用T4DNA連接酶在16 ℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌MC1061感受態細胞中，涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固體LB平板，37 ℃倒置培養16 h，挑取單菌落振蕩培養后用菌液進行PCR鑒定。提取陽性菌液的質粒，雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質粒送公司測序，測序結果正確的重組質粒保存待用。

1.12 Fiber2蛋白的表達及鑒定

將構建的重組質粒pNZ8148-Fiber2電轉化至乳酸菌NZ 9000感受態細胞并涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固體GM17平板，30 ℃倒置培養2～3 d。挑取單菌落于30 ℃靜置培養后用菌液進行PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液按1 ∶100體積比接種于40 mL含氯霉素(10 μg/mL)的液體GM17培養基，30 ℃靜置培養至菌液D600 nm達到0.4～0.6時，加入Nisin，使之終濃度為0、10、50、100 ng/mL，繼續誘導培養 12 h。8 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀，沉淀用PBS緩沖液洗2次后重懸，加入終濃度為 1 mg/mL 溶菌酶37 ℃孵育20 min。然后在超聲波下裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心 20 min 后分別取上清和沉淀，沉淀用等量PBS緩沖液重懸，分別取 30 μL 加蛋白上樣緩沖液煮沸后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白的表達方式。蛋白樣經SDS-PAGE分析后轉印到硝酸纖維素(NC)膜上，采用TBST溶液洗滌后，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫封閉 2 h，采用一抗稀釋液(6His-tag單克隆抗體，稀釋比為1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后用二抗稀釋液(HRP標記的羊抗鼠 IgG，稀釋比 1 ∶2 500)室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL顯影觀察。

2 結果與分析

2.1 病毒分離

由圖1可知，將處理后的病毒懸液無菌接種到LMH細胞盲傳至第3代96 h后出現明顯的細胞病變，表現為細胞間隙變大、形態皺縮，而對照組細胞生長良好、形態正常，未出現細胞病變。

2.2 PCR鑒定

由圖2可知，對鑒定引物擴增的DNA片段進行電泳檢測，得到的片段大小為958 bp，與目的片段大小一致。

2.3 病毒含量測定

以5 d的觀察結果為標準，通過計算得出第6代病毒的半數組織培養感染劑量(TCID50)為10-3.1/mL。

2.4 Hexon基因的擴增及測序

由圖3可知，對擴增DNA片段進行電泳檢測，結果得到3 144 bp大小的片段，與預期片段大小一致。經過克隆測序后，利用DNA Star對測序結果進行拼接，得到長度為2 814 bp的Hexon基因序列。

2.5 病毒Hexon基因的遺傳進化分析

將測序后拼接得到的Hexon基因序列與GenBank數據庫中的FAdV參考毒株進行BLAST比對，與FAdV-4同源性高達99.86%，說明成功分離了2株禽腺病毒4型，并分別命名為HBJZ2021A(病毒1)和HBJZ2021B(病毒2)。由圖4可知，將Hexon基因序列與數據庫中的34個 FAdV參考毒株的基因序列利用鄰接(Neighbor-Joining)法序列比對后構建遺傳進化樹，發現HBJZ2021A株和HBJZ2021B株病毒的親緣關系很近，處于同一小分支；而與國內山東、浙江和北京等地區的毒株親緣關系較近，處于同一分支；與國外巴基斯坦、奧地利、墨西哥等國家的毒株親緣關系較遠，處于不同的分支。

2.6 Fiber2基因的擴增

由圖5可知，以病毒全基因組為模板擴增的Fiber2基因產物，經電泳檢測得到1 440 bp大小的片段，與預期片段大小一致。

2.7 重組表達載體的構建與鑒定

由圖6可知，以隨機挑取單菌落過夜培養的菌液為模板，采用pNZ8148載體的通用引物進行PCR擴增，提取陽性菌液的質粒，重組質粒經限制酶HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，獲得2條特異性條帶。其中，一條為Fiber2基因片段(1 440 bp)，另一條為pNZ8148載體片段(3 167 bp)，與預期結果一致。重組質粒送公司測序，分析測序結果正確，表明成功構建了重組表達載體pNZ8148-Fiber2。

2.8 Fiber2蛋白的表達與鑒定

由圖7可知，設置Nisin濃度梯度對重組質粒乳酸菌NZ 9000誘導表達，對誘導所得蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳檢測， 約49 ku處出現1條特異性蛋白條帶，與預期蛋白大小一致，重組Fiber2蛋白成功在上清液中表達，同時在Nisin誘導濃度為 50 ng/mL 時表達量最大。經Western-Blot鑒定，由圖8可知， 結果顯示在49 ku處出現1條特異性印跡，進一步說明Fiber2蛋白表達成功。

3 討論與結論

禽腺病毒在LMH細胞上能夠穩定傳代并增殖，且病毒含量高[16]。在對LMH細胞常規傳代培養過程中發現，禽腺病毒不易貼壁、生長緩慢，參考ATCC官網上對LMH細胞培養方法的建議，采用 0.1% Gelatin溶液于4 ℃覆蓋處理細胞瓶內壁的方法有助于其貼壁。

根據遺傳進化樹可知，國內禽腺病毒毒株多為4型，其他型主要分布在國外，HBJZ2021A株和HBJZ2021B株與國內山東、浙江、北京、四川、上海、江蘇、黑龍江等地區的毒株親緣關系較近，處于同一個分支上。這與我國Ⅰ群禽腺病毒主要以血清4型為主，呈散發性流行[17]有關。2015年，禽腺病毒4型于山東地區暴發，隨后迅速傳播至周邊多個地區[16]。遺傳進化樹顯示，國內以山東地區毒株報道最多，其他地區多為零散報道，同時，部分山東地區毒株與巴基斯坦、墨西哥和加拿大等國外毒株親緣較近。這些側面說明了禽腺病4型是從山東地區傳入國內并傳播至湖北地區的，為我國湖北地區禽腺病4型流行病學情況提供了理論依據。

乳酸菌是一類在自然界和生物體中廣泛存在的革蘭氏陽性細菌，有多個分屬，是公認的綠色安全級微生物[18]。21世紀初，國內外學者致力于以乳酸菌作為基因工程受體菌對抗原、抗體、酶類、細胞因子等外源蛋白進行重組表達的研究[19-20]。乳酸菌可作為活載體疫苗菌株，具有以下突出優點：乳酸菌是無強抗原性的食品級菌種；自身分泌蛋白較少，降低了對外源重組蛋白的干擾；不會產生蛋白酶到胞外，使外源重組蛋白不易發生降解[21]。段欣強等將犬細小病毒VP2基因成功克隆至PMG36e載體，電轉至乳酸菌MG1363，成功表達了VP2蛋白，該研究為乳酸菌表達系統成功表達病毒衣殼蛋白提供了依據[22]。Nisin可誘導含有nisI基因的乳酸菌表達系統，可提高外源蛋白的表達量，且誘導效率是無誘導的1 000倍以上[23]。試驗采用不同濃度梯度Nisin對重組表達載體pNZ8148-Fiber2進行誘導，經SDS-PAGE電泳檢測發現，加入Nisin可提高重組Fiber2蛋白的表達量，并且在Nisin誘導濃度為50 ng/mL時，表達量最大。本研究為禽腺病毒4型湖北地區的流行情況及其口服疫苗的開發提供了參考依據。