4種水生植物修復對鹽堿土壤理化性質、酶活性和微生物群落組成的影響

沈 昀， 韓 冷， 曹佳倩， 徐康偉

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300； 2.金陵科技學院，江蘇南京 211169)

鹽堿化引起的土壤退化是制約農業生產的主要因素之一。土壤鹽漬化可在細胞、組織和分子水平上影響植物的生長代謝，造成植物生長早期的滲透脅迫和生育后期的離子脅迫[1]，最終導致作物減產，從而成為危及全球糧食安全的重要問題。目前全球約有8×1010hm2面積的土壤受到中度鹽漬化影響，隨著人類活動發展，鹽漬化土地面積仍在不斷擴大[2]。因此，合理開發利用鹽堿地已成為農業可持續化發展過程中亟待解決的問題。目前，采用物理、化學等多種技術單一或組合策略對鹽堿地進行改良，并取得了較佳效果[3]。但運用條件限制、高經濟成本及不良副作用等，使得相關技術無法普及。植物修復是通過種植鹽生植物以改善鹽堿地的一種經濟、環境友好型的方法[4]。目前許多鹽生植物已被運用于鹽堿地改良，且已馴化出功能性非鹽生植物以適應鹽堿地種植。研究表明，植物修復可有效改變土壤鹽分的分布，改善土壤導水率、容重、孔隙度及結構穩定性，從而影響土壤性質[5]。

微生物、植物和土壤之間存在復雜的相互作用，植物根際是微生物與植物相互作用的特殊區域，該區域直接受根系分泌物和殘體的影響。根際土壤微生物尤其是促進植物生長的根際細菌，在植物生長和抗逆性中發揮著重要作用[6]。植物在生長過程中主動向根際釋放大量生物活性物質、糖類和氨基酸等分泌物，招募大量微生物在根際定殖，從而影響根際微生物的群落結構。不同植物類型或品種分泌物的成分物質不同，對土壤微生物群落組成的影響也不盡相同[7]。根際微生物的群落結構還受土壤理化特性、營養狀況、水分等影響，鹽堿地的土壤鹽分和pH值高于非鹽堿地，因此土壤鹽分對土壤微生物群落的活性、多樣性和結構都有明顯影響[7]。

對功能性植物的挖掘與探索工作是開展相關研究的重要基礎。目前許多研究積極探索了改良鹽堿土的相關功能植物，以堿蓬[8]、草木樨[9]、蜀葵[10]等旱作植物為代表，在鹽堿地改良中表現出一定的效果。水生植物是指在水中或含水率較高的環境中生存的植物統稱，一般具有較高的初級生產力和代謝能力[11]。有研究表明，水生植物在水體、沼澤濕地、重金屬和養分富集及鹽堿脅迫等水分適中的環境中具有良好的功能修復作用[12]。Abro等研究表明，在鈣質高鹽土中種植水生植物蘆葦，可有效吸收Cl-和Na+，加速鹽堿地復墾[13]。在鹽堿地中連續2年種植含有蘆竹的組合性植物，土壤電導率、陽離子交換量及熱容量提高，植株Na+含量較對照增加近5倍，表明蘆竹可有效促進土壤鹽分析出并吸收累積[14]。劉曉靜等發現，在鹽堿地中，蘆葦、三菱草(Pinelliaternata)、香蒲等是主要的先鋒植物[11]。然而，目前鹽堿地植物修復的研究主要集中在旱作鹽生植物的功能形式及修復潛力方面，對鹽生植物根際土壤微生物群落的組成及相關功能差異很少涉及。因此，本研究探索了蘆葦、蒲菜(又稱香蒲)、紙莎草、蘆竹這4種水生植物對鹽堿土壤理化性質、酶活性及相關微生物群落組成的影響，以期為研究植物修復相關生物學機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2021年5—8月在江蘇農牧科技職業學院植物培養室中進行。空氣相對濕度為75%，溫度為18～28 ℃。4種水生植物分別為蘆葦[Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steu]、蒲菜(TyphaorientalisPresl)、紙莎草(Cyperuspapyrus)、蘆竹(ArundodonaxL.)，皆來自江蘇省沐陽縣九洲苗木場。

供試土壤取自江蘇省鹽城市大豐區郊外，該地區是江蘇省鹽堿面積最大且鹽堿程度最嚴重的區域。去除土壤表面的枯枝、雜草、石礫，鏟取0～30 cm 表層土壤。將土壤自然風干，混勻過4 mm網篩備用。供試土壤類型為水稻土，其pH值為8.20，自然含水量為81.1%，有機質含量為0.48%，全氮含量為0.66%，土壤鹽分含量為0.93%。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，原土培養，設置5個處理：CK，不種植物；LL，種植蘆葦；XP，種植蒲菜；LZ，種植蘆竹；ZSC，種植紙莎草。每個處理重復3次，共15桶試驗植株。

盆栽器具采用塑料圓桶，裝土10 kg/盆，將各處理的3株小植株移入桶中，保持土壤自然持水量(81.1%)。為保證早期幼苗的存活，加入100 mL全量植物營養液[15]。其間按照大棚內的溫度與蒸發水平，不定時適量加入水分。試驗培育145 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 土壤樣品采集 培養結束后，剪去植株地上部，去除0～1 cm表層土壤。采用環刀截取土壤，分析土壤容重(BD)與孔隙率(TPOR)。將培養器具剖開，去除距離根系較遠的外圍土壤，小心抖動根系表面土壤，無法抖落的土壤采用干凈刷子輕輕刷落。將各處理的土壤混合后分為3個部分：一部分保存于-20 ℃下，用于土壤Illumina Hiseq分析；一部分保存于-4 ℃下，用于土壤酶活分析；最后一部分采用自然風干研磨過篩，用于土壤性質分析。

1.3.2 土壤理化性質測定 土壤指標的測定按照鮑士旦的方法[16]進行。土壤pH值測定采用pH計進行(水 ∶土=2.5 ∶1)。土壤總鹽度(TS)采用電導法測定。土壤有機質含量(OM)采用K2Cr2O7氧化還原滴定法測定。總氮含量(TN)采用半微量開氏定氮法測定。堿解氮含量(AN)采用堿解擴散法測定。全磷(TP)、全鉀(TK)含量使用NaOH熔融后分別采用火焰光度法、鉬銻抗比色法測定。有效磷含量(AP)采用0.5 mol/L NaHCO3浸提分光光度法測定。土壤容重(BD)和總孔隙率(TPOR)均采用環刀法測定。

1.3.3 土壤酶活性及微生物數量測定 土壤酶活性包括亞硝酸還原酶(Nir)、脲酶(Ure)、纖維素酶(Cel)、木質素過氧化物酶(Lip)活性，分別采用杭州銳創生物技術有限公司生產的試劑盒G0310F、G0301F、G0308F、G0331F測定。

1.3.4 根際微生物群落Illumina Hiseq測序分析

1.3.4.1 土壤基因組DNA的提取、純化及Illumina-Mi Seq測序 采用DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，US)對土壤進行基因組DNA的提取。通過在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳并使用Nanodrop 2000分光光度計(thermo fisher scientific，Wilmington，DE)評估DNA濃度和質量。細菌擴增引物采用細菌16S rRNA V3～V4區間：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)。以土壤基因組DNA為模板，通過2輪PCR擴增法，具體反應條件及步驟參考Li等的研究[17]。2輪擴增結束后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增數量與質量，采用QIAquick Gel Extraction試劑盒(QIAGEN，Crawley，UK)純化。

1.3.4.2 DNA純化及Illumina-Mi Seq測序 對于PCR產物文庫和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物，選用0.6倍磁珠(VAHTS TM DNA Clean Beads)處理。使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina，USA)生成測序文庫，采用Illumina NovaSeq PE2500對基因文庫進行高通量測序。

1.3.4.3 Illumina-Mi Seq測序數據的處理 采用FASTP系統雙端讀數片段化和引物序列并去除低質量序列(信噪比>20)，以FASTQ文件格式儲存，采用FLASH對有效數據進行拼接。借助SSUrRNA數據庫(http：//www.arb-silva.de/)基于Mothur算法對相關代表性序列進行注釋分類信息，使用MUSCLE(Version 3.8.31，http：//www.drive5.com/muscle/)對相似度為97%的操作分類單位(OTU)信息進行歸一化，利用RDP對細菌Silva數據庫(SSU132)比對進行物種分類注釋，以獲取每條序列從門到屬的分類信息[18]。利用Mothur軟件統計每個生物樣本的Chao1、Shannon多樣性指數[19]。借助R語言計算并繪制未加權unifrac距離的非度量多維縮放(NMDS)的多元統計。利用高通量測序數據與土壤理化因子進行冗余分析(RDA)。以上分析委托杭州銳創生物技術有限公司完成。

1.4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據整理，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用鄧肯氏多重比較進行統計分析(α=0.05)，采用R語言、Origin 8.5進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 4種水生植物修復對鹽堿土壤理化性質的影響

由表1可知，4種水生植物修復處理對鹽堿土壤理化性質的影響差異顯著(P<0.05)。與對照(CK)相比，水生植物處理顯著降低了土壤的pH值、TS、BD，最小值分別出現在LL、LL、LZ處理，與CK相比，三者在上述3個指標中分別顯著降低7.32%、20.69%、19.08%。而在植物修復處理中OM、TN、TP、TK、AN、AP含量、TPOR均顯著增加，其最大值集中在LL處理或LZ處理。結果表明，水生植物修復處理對土壤理化性質有顯著影響，初步揭示蘆葦(LL)、蘆竹(LZ)處理可作為改善鹽堿地土壤性質的有效措施。

表1 4種水生植物修復對鹽堿土壤理化性質的影響

2.2 4種水生植物修復對鹽堿土壤酶活性的影響

由表2可知，亞硝酸還原酶(Nir)活性中，植物修復處理比CK高23.71～36.14倍，而XP、LZ、ZSC處理較LL處理分別低13.46%、33.46%、16.92%(P<0.05)。在脲酶(Ure)活性中，LL、XP處理顯著高于LZ、ZSC處理，且所有植物修復處理皆比CK顯著低36.86%～72.17%。纖維素酶(Cel)活性中，以LZ處理最低，與CK無顯著差異，兩者皆顯著低于其他植物修復處理，且以XP處理最大，為 10.43 mg/(d·g)。在木質素過氧化物酶(Lip)活性中，各處理數值表現為LZ

表2 4種水生植物修復對鹽堿土壤酶活性的影響

2.3 4種水生植物修復對微生物群落多樣性與豐富度的影響

Shannon指數、Chao1指數分別是反映微生物群落多樣性、豐富度的重要表征。由圖1可知，在4種水生植物修復處理與對照的Shannon指數中，各處理表現為CK

2.4 4種水生植物修復對微生物群落組成的影響

細菌基因序列隸屬于34門599屬。圖2-A顯示了所有土壤樣品中豐度較高的前10位優勢門，其中以變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最高，為31.67%～39.18%；其次是浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gematimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Patescibacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)，分別占總豐度的15.77%～25.02%、11.13%～15.51%、5.86%～11.16%、4.83%～7.34%、4.03%～5.56%、3.57%～4.52%、1.59%～3.69%、1.04%～1.86%、0.56%～1.64%。5個處理的酸桿菌門和放線菌門間的相對豐度存在顯著差異。LL、XP、ZSC處理顯著增加了酸桿菌門的相對豐度，并且在LZ處理中觀察到下降；而放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度在XP、LZ、ZSC處理中顯著增加，在LL處理中下降。此外，與CK相比，所有植物修復處理都增加了綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度。由圖 2-B 可知，在屬水平上，所有土壤樣品中排名前10位的依次為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、小梨形菌屬(Pirellula)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、Pir4_lineage、出芽菌屬(Gemmata)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、寡養單胞菌屬(Stenotrophobacter)、Subgroup_10、SH-PL14，不同處理中該10屬豐度總和為17.86%～22.23%，且不同處理間前10屬總豐度無顯著差異。與CK相比，所有植物處理均增加了小梨形菌屬(Pirellula)、SH-PL14、寡養單胞菌屬(Stenotrophobacter)的相對豐度，而降低了假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對豐度。

2.5 非度量多維尺度和冗余分析

基于unifrac距離的非度量多維尺度分析(NMDS)結果(圖3-A)表明，ZSC處理與其他處理無明顯交集而獨立于上半軸，LL、XP處理獨立于右下軸，而LZ處理間unifrac距離較遠，表明該處理微生物群落結構變異較大，此時與CK存在交集。總體而言，基于16S rRNA基因的所有水生植物修復處理之間存在明顯分離(R=0.909 6、P=0.001)，而LZ處理與CK無明顯分離。

冗余分析(RDA)可用于分析環境因子與相關微生物群落間的相關性，箭頭所處的象限表示環境因子與排序軸間的正負相關性。箭頭與原點的連線長度代表該環境因子與群落分布間的相關程度，連線越長，說明有相關性越大，反之越小。箭頭連線和排序軸的夾角代表某個環境因子與排序軸的相關程度，夾角越小，相關性越大，反之越小。細菌群落分析結果(圖3-B)表明，RDA的前2個軸分別解釋了總變異的23.7%和14.9%。就CK和ZSC處理而言，TS、pH值、BD與兩者均顯著相關，其中其TS關系最為密切。就LZ處理而言，OM、TK與其明顯相關，其中TK與其呈極顯著相關。就XP和LL處理而言，AN、Nir、Lip與其在0.05、0.01、0.001水平存在相關性。

3 討論與結論

種植鹽生植物或耐鹽植物進行植物修復是利用鹽堿地的重要手段[5，20]。現有的研究表明，植物修復不僅可以有效改變土壤中鹽分的分布，還可改變土壤性質，改善土壤質量，優化土地利用和促進植物生長[21]。植物和土壤微生物之間的相互作用在該修復過程中起關鍵作用，微生物可以促進植物生長并增強植物對逆境脅迫的抵抗力，反之植物介導微生物群落的多樣性、結構和組成的形成[22]。

土壤性質是土壤可用性及相關健康狀況的重要表征，如C/N、有機質(OM)含量以及pH值等，土壤性質可以與植物種類及地上植物覆蓋度相互作用[23]。植物可通過其本身作用影響土壤性質，同樣地，土壤也可以調節植物生長和種間競爭[22]。前人研究表明，鹽堿地種植菊苣(CichoriumintybusL.)顯著降低了土壤的鹽分分布，提高了根際有效養分[24]。本研究結果與前人研究結果趨于一致，即種植相關功能性植物后，土壤鹽分顯著降低，土壤氮、磷、鉀全量養分、速效養分和土壤孔隙度(TPOR)等明顯提高[25]。這可能是因為植物的根系活動可以激活土壤功能，加速土壤養分溶解，減少土壤水分蒸發，促進土壤膨壓轉換，從而改善土壤理化性質。前人研究表明，土壤鹽堿化會抑制土壤磷酸酶、脲酶及過氧化物酶等土壤酶活性[24]。本研究結果表明，鹽堿地土壤硝酸還原酶(Nir)、纖維素酶(Cel)及木質素過氧化物酶(Lip)活性顯著降低，脲酶(Ure) 活性升高，而在種植相關水生植物后，則呈相反趨勢。所有植物修復處理皆提高了氮循環中的關鍵酶——Ure的活性；Ure可將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少亞硝酸鹽在環境中的積累，降低亞硝酸鹽積累對生物體的毒性作用，這表明種植修復植物可以促進土壤的氮循環[19]。

植物根系可通過分泌物改變土壤的物理、化學和生物特性，還可以刺激土壤微生物群落的形成，從而調節養分循環，并保證植物生長和生態系統的可持續性[26-27]。根系分泌物的種類和數量決定了土壤微生物的種類和數量，進而影響微生物的生長、繁殖和代謝[7]。Eisenhauer等指出，根系分泌物介導的微生物相互作用，對土壤肥力、健康狀況和植物生長發育均具有重要作用[28]。本研究結果表明，與CK相比，LL、XP、ZSC處理皆增加了群落Alpha指數，其中多樣性顯著提高，而LZ的群落組成多樣性及豐度皆與CK相當。基于unifrac距離的非度量多維尺度分析(NMDS)顯示，除LZ處理與CK未明顯分離外，其他水生植物修復處理之間均存在明顯分離。這表明不同植物土壤微生物多樣性存在一定差異。不同植物產生的根系分泌物存在差異，這決定了特定植物中微生物的組成特征，因此微生物組成存在差異可能是由于不同植物分泌的代謝物不同[29]。在群落結構中，變形菌門(Proteobacteria)是各處理相對豐度占比最高的優勢門，其相對豐度占比31.67%～39.18%，該門包括固氮類細菌(如根瘤菌)[30]。

在屬水平上，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)為相對豐度最高的優勢屬，包含許多功能豐富的新型微生物資源，是最重要的優勢菌屬，也是目前研究中被廣泛認可的可改善逆境的指示性菌群。鞘氨醇單胞菌屬能在營養有限的環境中生存，表現出反硝化和非共生固氮的特點，可見其可能參與氮循環[31]。此外，鞘氨醇單胞菌屬還可用于芳香族化合物的生物降解，因此在環境污染中發揮著重要作用[32]，可能是該菌能成為鹽堿地優勢菌的原因。本研究發現LL、LZ處理顯著增加了鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度，可能是這2種植物可以富集土壤中的固氮菌，從而進一步改善土壤營養和質量，因此LL、LZ處理中TN、AN含量較高。此外，溶桿菌屬(Lysobacter)也是優勢屬之一，可分泌多種抗生素、酶和生物活性物質，抑制其他細菌并調節植物病害[31]。本研究中，LL、XP處理顯著增加了溶桿菌屬的相對豐度，說明這2種水生植物是鹽堿地修復的較佳選擇。

冗余分析(RDA)可用來描述土壤理化參數、酶活性和微生物群落分布之間的關系。以往的研究表明，pH值、SOC、AP和酶活性等環境因素決定了不同生態系統中的土壤微生物群落[19，33]。本研究中的RDA表明，pH值、TS、OM含量、TK含量、AN含量、BD、亞硝酸還原酶(Ure)活性和木質素過氧化物酶(Lip)活性是決定鹽堿地種植水生修復植物后細菌群落總量的主要因素。這些結果表明，土壤性質和酶活性是影響鹽堿地植物修復應用中微生物群落組成的主要驅動因素。