基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討心衰合劑治療心力衰竭的分子機(jī)制

楊 琳 王振裕 范德宇 鄭 珺 孟 袁 趙佳峪

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)2019級碩士研究生，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院干部保健科，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)2020級碩士研究生，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)2018級碩士研究生，北京 100029；5.北京中醫(yī)藥大學(xué)2021級碩士研究生，北京 100029)

心力衰竭是一種慢性、自發(fā)進(jìn)展性疾病，亦是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或終末階段[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，心力衰竭的發(fā)生與炎癥和重構(gòu)、心肌肥厚、離子缺陷等機(jī)制相關(guān)[2-3]，但對于心力衰竭的反復(fù)發(fā)作、患者生活質(zhì)量下降等問題尚缺乏理想的解決方案[4]。心力衰竭屬中醫(yī)學(xué)“心衰病”“心水病”“喘證”范疇。許心如教授認(rèn)為其主要的病機(jī)是氣虛水停，并首創(chuàng)“瀉肺利水”法治療心力衰竭的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，以《金匱要略》中防己黃芪湯和葶藶大棗瀉肺湯為主方組成心衰合劑，藥物包括黃芪、桑白皮、車前子、葶藶子、防己、赤芍、水紅花子，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用證實(shí)具有良好的治療效果[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于不同藥物之間在結(jié)構(gòu)、功效等方面的相似性，考慮機(jī)體內(nèi)生物效應(yīng)分子、靶標(biāo)分子的多種相互作用關(guān)系，通過與疾病相關(guān)基因進(jìn)行聯(lián)合分析，從而構(gòu)建出“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7-8]。這與中醫(yī)從整體出發(fā)，確定理法方藥，注重中藥間的“配伍”及“君臣佐使”的特點(diǎn)有異曲同工之處[9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”的多維網(wǎng)絡(luò)，探索心衰合劑治療心力衰竭的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 心衰合劑藥物活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)篩選出心衰合劑中藥物的活性成分(化合物)，按照化合物口服生物利用度(OB)≥20%、化合物類藥性(DL)≥0.1篩選，并篩選出化合物相對應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 心力衰竭疾病靶點(diǎn)篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)，以“Heart failure”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，收集心力衰竭相關(guān)疾病靶點(diǎn)，使用R語言4.04軟件進(jìn)行韋恩圖的繪制。

1.3 候選治療靶點(diǎn)的篩選 通過對心力衰竭疾病靶點(diǎn)和心衰合劑化合物對應(yīng)靶點(diǎn)取交集，獲得候選治療靶點(diǎn)，使用R語言4.04軟件進(jìn)行韋恩圖的繪制。

1.4 構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.7.2軟件將1.3中得到的候選治療靶點(diǎn)構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，并對各個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到其Degree值，即每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連線數(shù)目，并篩選出排名前7位活性成分作為關(guān)鍵成分，節(jié)點(diǎn)大小依據(jù)Degree值設(shè)置，Degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 利用基因間功能關(guān)聯(lián)關(guān)系數(shù)據(jù)庫(STRING)(https://string-db.org)對候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，置信度為0.95(Confidence=0.95)，去除離散的蛋白。

1.6 篩選核心治療靶點(diǎn) 將1.5中得到的蛋白輸入Cytoscape 3.7.2軟件，利用CytoHubba插件計(jì)算每個(gè)靶點(diǎn)的Degree、betweenness、eigenvecto、局部邊連通性(LAC)、network及closeness 6個(gè)參數(shù)，對這6個(gè)參數(shù)以中位值進(jìn)行2次篩選，得到核心治療靶點(diǎn)。

1.7 候選治療靶點(diǎn)的基因本體(GO)功能富集分析與京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 使用R語言4.04軟件對1.3中得到的候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析系統(tǒng)包括3個(gè)部分：生物過程(BP)、分子功能(MF)及細(xì)胞組分(CC)。對差異表達(dá)基因做GO功能注釋，挖掘各個(gè)基因所代表的生物學(xué)意義。

1.8 分子對接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)分別下載相關(guān)有效活性成分的小分子配體的2D結(jié)構(gòu)，再通過Chem 3D軟件將所有2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)，以mol2格式保存，導(dǎo)入到AutoDock Tools 1.5.6軟件中，以“pdbqt”格式保存。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)(http://www.rcsb.org/)分別下載核心治療靶點(diǎn)的蛋白受體結(jié)構(gòu)，利用Pymol 2.4.1軟件去除水分子，分離原配體，保存后導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件中加氫，以“pdbqt”格式保存。最后使用Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對接，通過Pymol軟件實(shí)現(xiàn)分子對接結(jié)果可視化，建立對接結(jié)果模式圖。

2 結(jié)果

2.1 心衰合劑藥物活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)獲取 經(jīng)過篩選，心衰合劑每種藥物的活性成分?jǐn)?shù)量如下表(見表1)，運(yùn)用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測模型對活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測并去重，得到活性成分共216個(gè)，得到潛在作用靶點(diǎn)284個(gè)。

表1 心衰合劑藥物活性成分?jǐn)?shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2 心力衰竭疾病靶點(diǎn)篩選 經(jīng)統(tǒng)計(jì)，GeneCards數(shù)據(jù)庫共有11 208個(gè)疾病靶點(diǎn)，DrugBank數(shù)據(jù)庫共有103個(gè)疾病靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫共有247個(gè)疾病靶點(diǎn)，PharmGKB數(shù)據(jù)庫共有1個(gè)疾病靶點(diǎn)，TTD數(shù)據(jù)庫共有71個(gè)疾病靶點(diǎn)，共得到疾病靶點(diǎn)1 1630個(gè)，使用R語言4.04軟件進(jìn)行韋恩圖的繪制并去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到疾病靶點(diǎn)11 215個(gè)。見圖1。

圖1 心力衰竭疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 候選治療靶點(diǎn)的篩選 對心衰合劑藥物靶點(diǎn)(2.1項(xiàng))和心力衰竭疾病靶點(diǎn)(2.2項(xiàng))取交集共得到255個(gè)候選治療靶點(diǎn)。靶點(diǎn)交集韋恩圖見圖2。

圖2 心衰合劑藥物-心力衰竭疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.4 “藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化 使用Cytoscape 3.7.2軟件將2.3項(xiàng)中得到的255個(gè)候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化(見圖3)，并篩選得到Degree值排名前7的關(guān)鍵成分依次為槲皮素(Degree值209)、山奈酚(Degree值61)、芹菜素(Degree值61)、異鼠李素(Degree值36)、黃芩素(Degree值28)、常春藤皂苷元(Degree值21)、兒茶素(Degree值13)(見表2)。

圖3 “藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

表2 心衰合劑治療心力衰竭的部分活性成分信息

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 利用STRING對2.3項(xiàng)中得到的255個(gè)候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，去除離散的蛋白，得到160個(gè)節(jié)點(diǎn)和467條邊的互作網(wǎng)絡(luò)。見圖4。

圖4 255個(gè)候選治療靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 篩選核心治療靶點(diǎn) 將2.5項(xiàng)中得到的160個(gè)蛋白輸入Cytoscape 3.7.2軟件，利用CytoHubba插件計(jì)算并篩選。首先以Degree>4、betweenness>36.7、eigenvector>0.025、LAC>1.143、network>2、closeness>0.106進(jìn)行第1次篩選，由160個(gè)蛋白篩選至47個(gè)，篩選網(wǎng)絡(luò)圖中黃色節(jié)點(diǎn)則是篩選到的蛋白(見圖5)。接下來再以Degree> 8.5、betweenness> 26.3、eigenvector>0.126、LAC>3.055、network>4.48、closeness>0.5進(jìn)行第2次篩選，由47個(gè)蛋白篩選得到15個(gè)，推測這15個(gè)蛋白為心衰合劑治療心力衰竭的核心治療靶點(diǎn)，依次為腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤蛋白p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、Ju-Nana原癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14、MYC、FOS、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、C-X-C基序趨化因子8(CXCL8)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1(RB1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)及IL-2。篩選網(wǎng)絡(luò)圖中黃色節(jié)點(diǎn)則是篩選到的蛋白(見圖6)。

圖5 第1次篩選得到的網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 第2次篩選得到的網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 候選治療靶點(diǎn)的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 對2.3項(xiàng)中得到的255個(gè)候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。共富集到175個(gè)KEGG通路，主要包含脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、磷脂酰肌酶3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人巨細(xì)胞病毒感染信號通路等。GO富集條目2873個(gè)，其中BP 2545條，主要有藥物反應(yīng)、對脂多糖抗氧化反應(yīng)等；CC 81條，主要有膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等；MF 247條，主要有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活動等。把KEGG通路富集結(jié)果的前30條通路用氣泡圖展示(見圖7)，GO功能富集結(jié)果分別取BP、CC、MF的前10條目用條形圖展示(見圖8)。

圖7 255個(gè)候選治療靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 255個(gè)候選治療靶點(diǎn)的GO功能富集分析條形圖

2.8 分子對接 對所有核心治療靶點(diǎn)與其對應(yīng)的藥物活性成分進(jìn)行分子對接處理，取結(jié)合能最小的3組進(jìn)行展示(見圖9～11)。

圖9 RELA與黃芩素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.4 kcal/mol)

圖10 FOS與黃芩素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.6 kcal/mol)

圖11 FOS與漢防己甲素分子對接結(jié)果(最低結(jié)合能-9.7 kcal/mol)

3 討論

心衰合劑是具有利水消腫、瀉肺平喘、益氣活血功效的中藥方劑，可有效改善心力衰竭患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)心衰合劑可以有效抑制慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)[10]。通過心衰合劑“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果顯示，常春藤皂苷元、山奈酚、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、兒茶素、黃芩素活性成分與候選作用靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度較大。常春藤皂苷元是一種五環(huán)三萜類化合物，體內(nèi)外研究證實(shí)常春藤皂苷元具有抗病毒、抗腫瘤、降血脂等重要的生物活性[11-12]。槲皮素、芹菜素、異鼠李素、黃芩素、山奈酚及兒茶素均屬于黃酮類化合物。槲皮素具有廣泛的心臟活性，可防止動脈粥樣硬化，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以拮抗心力衰竭，抑制心肌重構(gòu)，改善心功能[13-14]。芹菜素的心腦血管保護(hù)作用體現(xiàn)在抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等方面，同時(shí)芹菜素具有抗腫瘤、抗神經(jīng)退行性變及抗2型糖尿病等作用[15-16]。異鼠李素具有抗動脈粥樣硬化、抑制心肌纖維化和心肌肥大、抗高血壓、抗血栓等作用[17]。黃芩素可通過調(diào)節(jié)血管收縮、清除氧自由基等多種途徑，保護(hù)心腦血管及神經(jīng)[18-19]。山奈酚具有抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖與活化、預(yù)防心肌肥大等功效[20-21]。兒茶素具有抗氧化、抗炎等多種藥理活性，動物實(shí)驗(yàn)表明其可以通過抑制過度活化的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，顯著改善大鼠心力衰竭癥狀[22]。

通過對候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析，篩選出TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR等靶點(diǎn)可能為心衰合劑治療心力衰竭的核心靶點(diǎn)。TNF和IL-6是重要的炎癥因子，在心力衰竭、心肌細(xì)胞肥厚及凋亡中起到重要作用[23]。TNF可通過激活一氧化氮合酶、降低心肌收縮力等途徑，誘導(dǎo)心功能不全[24]，亦能通過蛋白酶途徑刺激細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)基礎(chǔ)代謝，TNF-α升高會引起過度的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致左心室功能不良及負(fù)性肌力作用[25-26]。IL-6可通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)生、增加負(fù)性肌力等途徑，參與心力衰竭過程[27]。TP53在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡與衰老的各種過程中具有關(guān)鍵作用[28]，TP53還能夠充當(dāng)心臟結(jié)構(gòu)和功能的多效調(diào)節(jié)劑，維持心臟功能穩(wěn)態(tài)[29-30]。RELA是核因子激活的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)家族成員之一，NF-κB能夠抑制心肌細(xì)胞黏附，保護(hù)心肌損傷[31]，具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡與抑制心肌細(xì)胞凋亡的雙重作用[32]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，RELA能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡及黏附功能，從而抑制動脈粥樣硬化進(jìn)展[33]。ESR在心肌肥厚及心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，其可能是通過抑制TNF-α的表達(dá)、激活A(yù)kt引起心肌細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，此外ESR還能與NF-κB協(xié)作，發(fā)揮抗心臟或血管損傷的作用[34-35]。

候選治療靶點(diǎn)的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，主要參與了脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路、PI3K/Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路等信號通路，主要涉及藥物反應(yīng)、對脂多糖抗氧化反應(yīng)等生物過程，膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等是參與反應(yīng)的主要細(xì)胞組分，分子功能主要包括細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活動等。大量臨床研究證實(shí)，動脈粥樣硬化是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)血管再生、調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、影響鈣離子通道、激活炎癥等機(jī)制在心力衰竭進(jìn)程中發(fā)揮重大作用[36]。Akt是PI3K的下游基因之一，其短期活化對衰竭早期的心肌細(xì)胞有益，能夠減少心肌細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號通路是調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的重要通路，在動員、遷移、分化及抗凋亡等方面具有明確作用，進(jìn)而參與流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化途徑[37]。同時(shí)流體剪切應(yīng)力在心血管系統(tǒng)疾病中起著重要的作用，可影響內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)與功能[38]。膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)均是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)組成，故推測細(xì)胞膜是發(fā)生生物反應(yīng)和進(jìn)行分子功能活動的主要位置。

最后對核心治療靶點(diǎn)及其對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接，得到3組結(jié)合能最小的組合：RELA與黃芩素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.4 kcal/mol)、FOS與黃芩素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.6 kcal/mol)、FOS與漢防己甲素結(jié)構(gòu)(最低結(jié)合能-9.7 kcal/mol)。核心治療靶點(diǎn)在與活性成分的分子對接模擬中呈現(xiàn)了良好的結(jié)合活性，驗(yàn)證了核心治療靶點(diǎn)和活性成分的合理性。以上結(jié)果表明黃芩素、漢防己甲素等活性分子可能作為潛在的藥物小分子作用于TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR、FOS等受體蛋白，進(jìn)而改善心力衰竭的癥狀。

綜上所述，心衰合劑治療心力衰竭可能是通過常春藤皂苷元、山奈酚、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、兒茶素、黃芩素等活性成分，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號等通路，作用于TNF、IL-6、TP53、RELA、ESR等靶點(diǎn)，涉及炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等機(jī)制，集中于膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等區(qū)域來實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步尋找心衰合劑藥物活性成分，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)與通路，分析心衰合劑多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。