三白草多糖微波提取工藝優化及降糖活性研究*

蘇才美，文 瑤

(廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006)

三白草(Saururuschinesis(Lour.)Baill)是三白草科多年生草本植物，味甘、辛，性寒，有著清熱解毒、利尿消腫等功效[1]。三白草藥理作用包括抗炎、抗氧化、降血糖及抗腫瘤活性等[2,3]，化學成分為多糖、揮發油、木脂素、生物堿和黃酮類化合物等[4]。文獻報道，三白草提取物均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性[5]。三白草作為中藥材之一，但對其的研究與其他藥材相比較少，其藥理作用的研究還有待發展。因此，為了提高三白草多糖的提取率，本文采用微波輔助水提法提取三白草多糖，響應面法優化其提取條件。多糖粗品經DEAE和G-75柱純化獲得三白草多糖。通過α-葡萄糖苷酶的抑制實驗評估三白草多糖的降血糖能力。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

三白草：購于安徽省毫州市，4 ℃保藏備用。

G-75、DEAE，匯研生物科技有限公司；阿卡波糖，阿拉丁；α-葡萄糖苷酶，源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的制備

參考李珊等[6]的方法，配制質量濃度為 0.4 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。精密移取 10 μL，20 μL，30 μL，40 μL，50 μL 標準溶液于ep管中，用蒸餾水分別補足成 100 μL，加5%的苯酚溶液 0.1 mL，加濃硫酸溶液 0.5 mL，測定吸光度，平行3次。以葡萄糖溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作葡萄糖標準曲線，所得標準曲線方程為Y=4.6815X-0.014(R2=0.9979)。

1.2.2 三白草多糖提取及含量測定

稱取 2 g 三白草，進行超聲提取，離心，取濾液，濃縮至 3 mL。調節乙醇質量分數至80%，冷藏 12 h，離心，棄上清液，加入Sevag試劑除蛋白，離心，取上層溶液得到粗多糖溶液，苯酚-硫酸法顯色。在最合適波長處測定吸光度，平行3次。利用下式計算三白草多糖的提取率。

W=C×V×N/M×100%

(1)

式中：W為三白草多糖的提取率，%；N為稀釋倍數；C為多糖的質量濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；M為三白草質量，mg。

1.2.3 單因素試驗

1)最佳液料比的選擇

選擇液料比為5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 mL/g，調節微波功率至 260 W，微波提取 60 s；

2)最佳微波時間的選擇

選擇微波時間為 30 s，60 s，90 s，120 s，150 s，180 s，液料比為上述實驗選出的最佳值，微波功率為 260 W；

3)最佳微波功率的選擇

選擇微波功率為 220 W，340 W，460 W，580 W，700 W，液料比和微波時間為上述實驗選出的最佳值。

1.2.4 響應面分析法優化提取工藝

綜合單因素實驗所得到的結果，以Box-Benhnken的中心組合實驗原理為依據，采用響應面法在三因子三水平上對三白草多糖的提取條件進行優化。

1.2.5 普通水提法

稱取 2 g 三白草粉末，以25∶1 mL/g的液料比加入一定量的熱水，提取 90 s，采用苯酚—硫酸法顯色，測定提取率。

1.2.6 驗證實驗

稱取 2 g 三白草藥材粉末，按照響應面優化得出的最優條件進行提取，離心，收集上清液，經過醇沉，除蛋白后，濃縮，取 0.1 mL 于ep管中，苯酚-硫酸法顯色，測定吸光度，平行3次。

1.2.7 粗多糖的分離純化

參考葛智超等[7]方法，取 15 mL 樣品溶液上樣于DEAE纖維柱。先后用蒸餾水和梯度氯化鈉進行洗脫。采用苯酚—硫酸法示蹤，繪制洗脫曲線，不同的峰分開收集。

將上述溶液收集，濃縮干燥得到樣品。取 50 mL 樣品上柱于G-75柱，調節流速為 0.5 mL/min，用蒸餾水進行水洗。采用苯酚—硫酸法示蹤，繪制洗脫曲線，不同的峰分開收集。

1.2.8 降血糖活性試驗

根據文獻方法[8]，將所有樣品或阿卡波糖(40 μL，0～3200 μg/mL)與α—葡萄糖苷酶(40 μL，0.2 U/mL)于細胞板中混合并在 37 ℃ 下烘箱孵化 5 min，將PNPG(20 μL，10 mM)加入到混合溶液中繼續在 37 ℃ 下反應 30 min，加入碳酸鈉(100 μL，0.1 mol/L)終止反應，在 405 nm 下測定吸光度，抑制率計算公式如下：

式中：As為樣品溶液、α-Glucosidase和PNPG混合溶液的吸光度；Ab為樣品溶液和PNPG混合溶液的吸光度；A0為α-Glucosidase和PNPG混合溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比的影響

由圖1可得知，多糖提取率的變化趨勢。三白草多糖提取率在比值為25∶1 mL/g前，隨著液料比的增大而呈現上升的趨勢。液料比為25∶1 mL/g時，多糖提取率達到峰值0.72%，與其他組差異顯著(P<0.05)，隨后再增加液料比多糖提取率反而有下降趨勢。因此，選用液料比25∶1 mL/g進行后續實驗。

圖1 液料比對三白草多糖提取率的影響

2.1.2 微波時間的影響

由圖2可知，多糖提取率的變化趨勢。當微波時間在30～90 s 的范圍內，三白草多糖提取率與微波時間呈正相關性，隨其增加而增加，峰值出現在 90 s 時，提取率為1.02%，與其他組差異顯著(P<0.05)。在峰值后提取率出現下降趨勢。因此，選用微波時間 90 s 為最佳條件進行后續實驗。

圖2 微波時間對三白草多糖提取率的影響

2.1.3 微波功率的影響

由圖3可知，多糖提取率的變化趨勢。當微波功率在220～460 W 內，微波功率的上升，三白草多糖的提取率也逐漸升高，并在 460 W 處有峰值，此時的多糖提取率為1.98%，與其他組差異顯著(P<0.05)，隨后微波功率的上升不會導致提取率繼續增高，反而有所降低。因此，選用微波功率 460 W 為最佳條件進行后續實驗。

圖3 微波功率對三白草多糖提取率的影響

2.2 響應面優化結果與分析

根據表1的結果，采用Design Expert 8.06軟件對表1中的數據進行二次多項式擬合，從而得到三白草多糖提取率(Y)對液料比(A)，微波時間(B)和微波功率(C)的回歸方程為：Y=2.38+0.13A+0.038B+0.051C-0.12AB-0.089AC+0.084BC-0.62A2-0.25B3-0.11C2。得到的方差分析結果如表2所示。

表2 方差分析

由表2看出，該回歸模型的P值為0.0035，因為P值<0.05時，所以認為該模型顯著，模型失擬項為0.5328，當該項>0.05時，可認為失擬項不顯著。由表2中看出，對三白草多糖的提取率的影響具有一定的顯著性的是液料比，而時間與功率則沒有。根據表2中A、B、C對應的F值可得，液料比>時間>功率是影響三白草多糖提取率的三個單因素的影響順序。

表2 方差分析

圖4、圖5、圖6分別為液料比、微波時間及微波功率中的任意一個變量為0時，其它兩個變量對三白草多糖提取率的交互作用影響。

圖4 液料比和微波時間對三白草多糖提取率的影響

圖5 液料比和微波功率對三白草多糖提取率的影響

圖6 微波時間和微波功率對三白草多糖提取率的影響

由圖4～圖6看出，液料比和微波時間的響應面的曲面最陡，說明相對于其他兩個因素的交互作用而言，AB交互作用對三白草多糖提取率的影響較大。這與方差分析結果表的數據一致。由圖4～圖6可以看出，液料比的等高線最為密集，所以液料比對三白草多糖提取率的影響最為明顯，其次是微波時間，微波功率是對三白草微波提取多糖影響最小的因素。此結果也與方差分析結果一致。

2.3 驗證實驗

通過響應面軟件對數據的分析優化，確定液料比25∶1 mL/g，微波時間 90 s，微波功率 460 W 為本實驗的最佳優化條件參數，三白草多糖理論提取率可達到2.57%。在此最佳條件下做驗證實驗，實際得到的平均提取率為2.51%，此結果與響應面的回歸方程所得的理論值一致性較高，表明此條件可行性高。與普通水提法的0.9%提取率相比，優化效果良好。

2.4 三白草粗多糖的分離純化

由圖7可看出，水洗部分，得到兩個峰，表明分離得到兩個組分，記為：SP-1和SP-2。鹽洗部分得到三個峰，表明分離得到三個組分，記為：SP-3，SP-4和SP-5。水洗所得到的組分的量較少。對于鹽洗的組分，選擇量最高的SP-3進行下一步的純化。

圖7 三白草多糖DEAE-纖維柱的洗脫曲線

將上述獲得的SP-3經過Sephadex G-75層析柱的分離純化，得到如圖8所示的洗脫曲線，可以得出洗脫出來的組分較為單一，證明了SP-3經過純化后，得到的是較純多糖。

圖8 三白草多糖Sephadex G-75的洗脫曲線

2.5 三白草多糖降血糖活性

由圖9可看出，當SP-3最高抑制率為91.61%，此時SP-3的質量濃度為 3.2 mg/mL，說明該多糖具有明顯抑制α—葡萄糖苷酶的活性。SP-3的IC50值為 0.002 mg/mL，小于阿卡波糖(0.003 mg/mL)，說明三白草多糖的降血糖作用高于陽性藥阿卡波糖。

圖9 三白草多糖體外對α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲線

3 結論

本研究探討了三白草多糖的最佳微波輔助提取工藝參數及其降血糖活性。結果表明，三白草多糖的最佳提取條件為液料比 25 mL/g、微波時間 90 s、微波功率 460 W。在該條件下得到的三白草多糖提取率為2.57%，與普通水提法相比，提取率有所提高。采用DEAE與G-75柱純化得到三白草精多糖。此外，降血糖實驗結果顯示，三白草IC50值小于阿卡波糖，即三白草多糖對α—葡萄糖苷酶的抑制作用比阿卡波糖強。實驗結果可為三白草多糖的提取以及日后的實際生產應用提供一定的理論依據。