草烏甲素閃式提取工藝優化及熱穩定性研究

付彬彬，龔云麒，周 劍，劉建文，劉軍鋒

(昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650021)

草烏甲素(Bulleyaconitine A，分子式C35H49NO10，相對分子質量643.76)，又名滇西嘟拉堿甲，為白色結晶或結晶性粉末，最早是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉(aconitum bulleyanum diels)中分離出的一種具有生物活性的生物堿[1-2]。因具有較強的鎮痛及免疫調節等藥理活性，草烏甲素現如今作為一種現代植物藥，廣泛應用于風濕性及類風濕性關節炎、骨關節炎、腰肌勞損、肩周炎、四肢扭傷等的治療[3-7]。草烏甲素具有鎮痛時間長，副作用小，療效明確，且對器官無明顯損傷等特點。相比于傳統的鎮痛藥，草烏甲素沒有阿片類鎮痛藥的成癮性及耐受性等副作用，也沒有非甾體消炎藥類鎮痛藥的胃腸道損傷、出血及腎毒性等不良反應[8]。

近年來，草烏甲素及其制劑在疼痛治療領域的臨床價值不斷被認可，連續列入了帶狀皰疹后神經痛、神經病理性疼痛、腰背痛全國專家共識推薦用藥。隨著草烏甲素制劑在疼痛病領域的廣泛應用，草烏甲素原料藥的需求也在不斷增加。現如今，草烏甲素原料藥主要來源于烏頭屬類植物的提取分離。因此，通過草烏甲素閃式提取工藝優化及熱穩定性研究，為草烏甲素的提取純化工藝水平的提升提供科學依據。

閃式提取是一種新型提取方法，具有提取速度快、提取時間短、有效成分破壞少等優點[9]，其原理是物料在提取器內通過高速粉碎、快速攪拌、高速振動等方式使有效成分迅速達到組織內外平衡[10]。此次試驗以長喙烏頭粗粉為原料，探究長喙烏頭閃式提取最佳工藝條件及對提取液的熱穩定性進行考察。

1 實驗材料與儀器

高效液相色譜儀(LC-2030C，日本島津)；JHBE-50T閃式提取器(河南智晶生物科技)；BP221S型分析天平(北京賽多利斯儀器公司)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；DFY-1000D型高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

長喙烏頭(麗江永勝)，草烏甲素對照品(中國藥品生物制品檢定所)，乙腈(色譜級，上海星可)，磷酸(色譜級，阿拉丁)，乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)，純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID×250 mm)，0.2%三乙胺水溶液(用磷酸調節pH值至3.1±0.1)-乙腈(65∶35)為流動相;流速 1.0 mL/min;檢測波長 260 nm; 柱溫 25 ℃；進樣量:10 μL；理論塔板數按草烏甲素峰計算應不低于3000[11]。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 草烏甲素對照品色譜圖

圖2 長喙烏頭藥材色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取草烏甲素對照品 11.5 mg，置于 100 mL 量瓶中，加少量 0.1 mol/L 鹽酸溶解后，加水稀釋制成 40 μg/mL 草烏甲素，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

準確稱取本品粗粉 0.5 g，置予具塞錐形瓶中，加入50%甲醇 50 mL，稱定質量，超聲處理(功率 250 W，頻率 35 kHz )30 min，放冷，再稱定質量。用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取過濾液，作為供試品溶液。

2.4 儀器精密度試驗

以同一份對照品溶液連續進樣7次，草烏甲素峰平均保留時間為 12.64 min，RSD=0.36%；平均峰面積697.66，RSD=0.16%。表明儀器重復性好。

2.5 穩定性試驗

草烏甲素對照品溶液在 0、2、4、8、12、24、48 h 時分別測定，以峰面積計算RSD，為0.28%。結果表明，草烏甲素溶液在 48 h 內穩定。

2.6 標準曲線

精密稱取草烏甲素對照品 20.8 mg，加 0.1 mol/L 鹽酸溶解后，加水稀釋定容至 100 mL 容量瓶中，制成儲備液(0.208 mg/mL)。分別精密量取儲備液2.5、3.5、4.0、5.0、5.5、6.5、7.5 mL，分別置予 25 mL 量瓶中，加水稀釋制成一系列梯度濃度的溶液。分別取 10 μL 進高效液相色譜儀，波長 260 nm 處測定峰面積，以草烏甲素的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算。線性回歸方程為：Y=17.244X-8.820，r=0.9998(n=7)。結果表明，草烏甲素在 20.8～62.4 μg/mL 范圍內，峰面積和質量濃度呈良好線性。

3 正交試驗設計提取工藝

3.1 因素水平設計

根據文獻研究和預實驗，分別考慮乙醇質量分數、料液比例、提取時間、提取次數為影響因素，采用L9(34)正交試驗設計，以草烏甲素提取率為考察指標，確定正交試驗的最佳試驗方案。見表1。

3.2 正交試驗結果

正交試驗結果詳見表2、表3。

表2 閃式提取法正交試驗設計及結果

表3 閃式提取的方差分析

由草烏甲素方差分析(表3)得出：提取次數(D)與料液比(B)有顯著性，為顯著因素。直觀分析四個影響因素大小順序為D>B>C>A；其中A2> A1> A3；B3> B2> B1；C3> C1> C2;D3> D2> D1。根據實驗結果，長喙烏頭中草烏甲素閃式提取方案應為A2B3C3D3。即：70%乙醇，料液比 1∶8 g/mL，提取時間 30 min，提取4次。

3.3 驗證性實驗

如表4所示，采用正交試驗優化出的長喙烏頭閃式提取最佳方案，重復實驗3次，得到平均提取率為93.08%，均高于正交實驗9次結果，證明優選出的長喙烏頭閃式提取工藝效率高、穩定、可靠。

表4 驗證性實驗結果

4 長喙烏頭提取液熱穩定性的考察

將上述驗證性實驗得到的長喙烏頭閃式提取液(20201215批)置于 10 mL 容量瓶中，定容，置于一定溫度(恒溫)水浴鍋內靜置保溫，分別在 0、1、2、4、8、12、24 h 時取出一個容量瓶，冷卻至室溫，用75%乙醇補充損失體積，重新定容。其中，水浴溫度為 70 ℃、75 ℃、78 ℃。高效液相色譜法檢測每份容量瓶中草烏甲素的質量濃度，結果如表5所示。

表5 長喙烏頭提取熱穩定性考察結果

將表5中實驗結果以時間為橫坐標，草烏甲素質量濃度為縱坐標，繪制出草烏甲素在一定溫度下質量濃度隨時間變化的趨勢圖，如圖3所示。

圖3 草烏甲素熱穩定性趨勢圖

從圖3中看出，草烏甲素的質量濃度隨著水浴時間和水浴溫度的增加逐漸降低，在 78 ℃ 條件下，草烏甲素的質量濃度在 24 h 內下降了85.7%，說明提取液中的草烏甲素具有熱不穩定性，不能長久置于高溫(≥70 ℃)環境中。但從數據也可知，提取液在 75 ℃ 以下環境中，0～4 h 內草烏甲素的質量濃度變化不大，為可控范圍。

5 結論

本實驗以乙醇質量分數、料液比例、提取時間、提取次數為考察對象，正交實驗設計得到長喙烏頭閃式提取最佳工藝參數，即：乙醇質量分數70%，料液比例 1∶8 mg/L，提取時間 30 min，提取次數4次。重復驗證最佳工藝參數的草烏甲素提取率為93.08%,說明優選出的長喙烏頭閃式提取工藝效率高、穩定、可靠。長喙烏頭提取液熱穩定性考察，說明提取液中的草烏甲素具有熱不穩定性，不能長久置于高溫(≥70 ℃)環境中。

研究結果提示，在提取、濃縮等工藝步驟中，應控制溫度及加熱時間，以避免草烏甲素降解，閃式提取法因提取時間短、效率高、提取溫度低等優點，在草烏甲素的提取上具有一定的推廣意義。