氣相色譜-靜態頂空與直接進樣測定酒中的甲醇及比較

馬艷紅，刁玉華，萬 靜

(昆明市食品藥品檢驗所 食品檢驗中心，云南 昆明 650010)

甲醇，又稱木醇、羥基甲烷，是無色透明、易揮發的液體，沸點 64.7 ℃，對人體有害，容易在體內蓄積并損傷多處器官[1]。甲醇毒性作用主要是由甲醇本身及代謝產物(甲醛和甲酸)引起的，以中樞神經系統損傷、代謝性酸中毒及眼部損傷為主，人攝入甲醇5～10 mL 可致嚴重中毒，7～15 mL 以上可致失明，30 mL 以上可致死亡[2-3]。由于原料的植物細胞壁及細胞間質含有果膠，在酒的釀造過程中不可避免有甲醇的產生，特別是，果膠含量較大的糧谷和水果受熱或在酶的作用下分解產生的甲醇含量更高[4-5]。通常，雖然酒中含有微量的甲醇是正常的，但是由于一些生產者釀造工藝技術的不完善或不良商家人為摻假、制售假酒等造成酒中甲醇超標，嚴重危害廣大消費者的生命安全[6]。GB 2757-2012《食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒》規定了甲醇在酒類樣品中的最大殘留限量，糧谷類和其他類蒸餾酒的配制酒最大殘留限量分別為 0.6 g/L 和 2.0 g/L[7]。GB/T 15037-2006《葡萄酒》也特別說明了白、桃紅葡萄酒和紅葡萄酒中甲醇的最大殘留限量分別為 250 mg/L 和 400 mg/L[8]。

目前，對酒中甲醇的檢測方法主要有氣相色譜法[9-14]、氣相色譜-質譜聯用法[15-17]、比色法和分光光度計法[18-19]。氣相色譜法具有較高的靈敏度、較好的穩定性、極高的準確性，因而已成為酒中甲醇檢測的最主要方法。我國于2017年6月23日實施的GB 5009.266-2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》就是采用配置FID檢測器的氣相色譜法對酒精、蒸餾酒、配制酒及發酵酒中甲醇的測定[20]。其中，酒精、蒸餾酒及其配制酒直接取樣測定，但發酵酒及其配制酒還需進行蒸餾處理,去除可能污染儀器和色譜柱的營養成分、微量元素及色素等，例如葡萄酒。在長期使用標準檢測的過程中發現，許多醬香型白酒由于成分比其它白酒復雜，造成在檢測時甲醇峰較難完整、清晰地分離開，嚴重影響定量的準確性。本實驗旨在通過比較靜態頂空和直接進樣法探究酒中甲醇的測定,靜態頂空法一方面可以高效處理樣品，發酵酒及其配制酒無需進行蒸餾，減輕前處理負擔并有效避免蒸餾過程中甲醇的損失；另一方面，對較難分離出良好甲醇峰形的醬香型白酒，可以得到分離完好、清晰的甲醇峰，增強定量的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

標準品：φ(甲醇)≥ 99.7%，CAS 67-56-1，DR EHRENSTORFER。試劑：φ(乙醇)≥99.8%，色譜純，Fisher Chmical；超純水。白酒質控樣品：QC-DL-702，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；紅酒質控樣品：FD192-QC，LGC；市售醬香型白酒3份，普通白酒2份(清香型白酒和高粱酒)，白葡萄酒2份，紅葡萄酒2份。

1.2 儀器設備

氣相色譜儀(配FID檢測器)，島津GC-2010Plus；頂空進樣器，島津HS-20；十萬分之一電子天平，美國梅特勒托利多公司；旋渦混合器 海門其林貝爾公司；超純水制備器，賽多利斯。

1.3 方法

外標法定量[測定結果均按酒精度100%(體積分數)計算]。

1.3.1 溶液配置

40%乙醇水溶液：準確移取 200 mL 無水乙醇至 500 mL 容量瓶，用超純水定容至刻度線，混勻待用。

1.3.2 頂空進樣法

1.3.2.1 標準工作溶液

準確稱取 25.30 mg 甲醇標準品于 25 mL 容量瓶，用40%乙醇水溶液定容至刻度線并混勻，得 1.012 mg/mL 甲醇儲備液。再用40%乙醇水溶液將儲備液依次稀釋為 5.06、10.12、50.6、101.2、253.0、506.0、809.6 μg/mL 的系列標準工作溶液，并各準確移取 5 mL 至 20 mL 頂空進樣瓶中，壓緊瓶蓋密封、混勻。

1.3.2.2 樣品前處理

通過事先模擬頂空恒溫狀態，將裝有 5 mL 紅酒的頂空瓶在 70 ℃ 下恒溫 20 min，移出瓶內蒸汽再經冷卻后，冷凝液無色透明，污染物減少，說明對于紅酒頂空進樣無須進行蒸餾。所以室溫下混合均勻樣品，從中準確移取 5 mL 至 20 mL 頂空進樣瓶，壓緊瓶蓋密封，待上機測定。

1.3.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：聚乙二醇石英毛細管柱 DB-WAX UI(60 m×0.250 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度 40 ℃ 保持 5 min，以 3 ℃/min 升至 70 ℃ 不保持，再以 30 ℃/min 升至 230 ℃ 保持 2 min；檢測器溫度：250 ℃，氫氣流量 40.0 mL/min，空氣流量 400.0 mL/min，載氣：高純氮氣(φ≥99.999%)；進樣器：恒溫爐溫度為 70.0 ℃，樣品流路溫度為 100.0 ℃，傳輸線溫度為 120.0 ℃，樣品恒溫時間為 20.0 min，樣品加壓時間 1.0 min，加壓平衡時間 0.1 min，進樣時間 0.5 min，GC循環時間 32.0 min，分流比為50∶1，色譜柱流量 1.2 mL/min。

1.3.3 全自動直接進樣法

1.3.3.1 標準工作溶液

準確稱取 25.04 mg 甲醇標準品于 25 mL 容量瓶，用40%乙醇水溶液定容至刻度線并混勻，得 1.0016 mg/mL 甲醇儲備液。再用40%乙醇水溶液將儲備液依次稀釋為 5.008、10.016、50.08、100.16、250.40、500.80、801.28 μg/mL 的系列標準工作溶液，混勻。

1.3.3.2 樣品前處理

室溫下混合均勻樣品，澄清試樣過 0.45 μm 濾膜后混勻，移取 1 mL 至進樣小瓶；顏色較深試樣經蒸餾(按GB 5009.266-2016標準方法操作)后混勻，過 0.45 μm 濾膜并移取 1 mL 至進樣小瓶，待上機測定。

1.3.3.3 氣相色譜條件

進樣器：全自動進樣，進樣口溫度為 220 ℃，進樣量為 0.5 μL，分流比為20∶1，色譜柱流量 1.2 mL/min。色譜柱、檢測器、程序升溫條件同1.3.2.3。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

由于甲醇和40%乙醇水溶液極性較大，根據色譜柱的使用規則及相似相溶原理，選擇WAX型的聚乙二醇石英毛細管極性色譜柱，確保甲醇有足夠的靈敏度和分離能力。使用WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)兩種色譜柱測定甲醇，通過減少進樣量、降低初始溫度、延長低溫保持時間、降低色譜柱流量、減慢升溫速率等操作均難以和溶劑乙醇峰分開，不利于定量分析。采用 60 m 長的色譜柱DB-WAX UI(60 m×0.250 mm×0.25 μm)增強分離效能，達到甲醇峰完整、清晰地分離開，峰形尖銳、對稱，可進行準確地定性定量分析，所以本實驗選擇 60 m 長的極性色譜柱(見圖1)。

圖1 三種不同長度色譜柱的甲醇色譜圖

2.2 氣相色譜條件優化

首先，按照GB 5009.266-2016標準給定的儀器參考條件設為方法一：全自動進樣，進樣量為 1 μL；進樣口溫度為 220 ℃，分流比為20∶1，載氣流量 1.0 mL/min；檢測器溫度為 250 ℃；程序升溫：初始溫度 40 ℃ 保持 1 min，以 4 ℃/min 升至 130 ℃ 不保持，再以 20 ℃/min 升至 200 ℃ 保持 5 min。該方法均沒能實現白酒中甲醇的分離，紅酒中甲醇出峰均拖尾嚴重。接著設置方法二：把進樣量改為 0.5 μL，其余條件同方法一。該方法對紅酒和大多數白酒中甲醇分離良好，能滿足基本定性定量要求，但是對醬香型白酒依然實現不了甲醇分離。最后優化得方法三：進樣量為 0.5 μL，載氣流量 1.2 mL/min，程序升溫：初始溫度 40 ℃ 保持 5 min，以 3 ℃/min 升至 70 ℃ 不保持，再以 30 ℃/min 升至 230 ℃ 保持 2 min，其余條件同方法一。該方法可實現紅酒和所有白酒中甲醇的分離，出峰不與其它組分重疊，而且適當提高載氣流量起到了改善拖尾的效果，三個方法分離情況見圖2。因此，這里選擇方法三作為全自動進樣的色譜條件。

圖2 同一醬香型白酒在直接進樣三種方法中甲醇出峰情況

同理，頂空進樣量也不宜過大。本實驗通過控制進樣時間 0.5 min 并增大分流比至50∶1來控制低進樣量。控制已優化頂空進樣器條件不變，分別設置方法四、方法五、方法六。方法四按方法一檢測器、程序升溫、載氣流量條件設置，該方法不能有效分離出甲醇峰。方法五檢測器、程序升溫條件同方法三，載氣流量 0.8 mL/min，該方法對醬香型白酒依然不能使甲醇完整清晰地分離開。方法六檢測器、程序升溫條件同方法三，載氣流量 1.2 mL/min，該方法適當提高載氣流量，可實現紅酒和全部白酒中甲醇的分離，特別是上述甲醇未分離開的醬香型白酒，甲醇出峰完整、尖銳、對稱。三個方法分離情況見圖3。因此，這里選擇方法六作為頂空進樣的色譜條件。

圖3 同一醬香型白酒在頂空進樣三種方法中甲醇出峰情況

2.3 頂空平衡條件的探究

本實驗主要探究頂空進樣中平衡溫度、平衡時間對頂空進樣時的影響，并選擇最優條件進行試驗。

2.3.1 平衡溫度

對于頂空進樣，提高樣品瓶的溫度，有利于降低待測物在瓶內的分配系數，增大待測物在瓶內氣相中的濃度，從而增加頂空分析的靈敏度。但是該溫度也應低于溶劑沸點，不能引起溶劑沸騰并避免頂空瓶脹裂脹破。根據甲醇沸點 64.7 ℃，溶劑和樣品主要為乙醇水溶的特點，本實驗選擇對60、64.7、70、75、80 ℃ 5個溫度進行探究對比。試樣和其它條件保持一致，同一試樣中甲醇響應值均隨溫度升高而增大，再結合甲醇峰分離情況來看，70 ℃ 時分離情況最好。特別是醬香型白酒，75 ℃ 和 80 ℃ 時甲醇峰不能和甲醇之后的其它組分峰有效、完全分離開(見圖4)。所以綜合考慮，選擇 70 ℃ 作為平衡恒溫時間，即達到了足夠的靈敏度，又能實現甲醇良好地分離。

圖4 同一醬香型白酒不同平衡溫度下甲醇出峰情況

2.3.2 平衡時間

控制頂空平衡溫度為 70 ℃，對同一均勻試樣在平衡時間為 10、15、20、25、30、40 min 下各進行3次平行測試，結果是當時間增加至 20 min 時，甲醇已達到最大響應，繼續延長平衡時間甲醇響應已不再發生明顯變化(見圖5)，同時6個恒溫時間下，甲醇峰分離均完整且不與前后峰交疊。所以本實驗選擇 20 min 作為頂空進樣的平衡時間。

圖5 同一試樣平衡時間與響應值之間關系

2.4 數據結果分析與比較

2.4.1 標準曲線

將1.3.2.1配制的標準工作溶液按1.3.2.2條件通過靜態頂空進樣；將1.3.3.1配制的標準工作溶液按1.3.3.2條件通過直接進樣，分別得到兩種進樣測定的甲醇標準溶液峰面積數據，并繪制得兩種進樣方式的標準曲線，結果見表1、圖6、圖7。質量濃度范圍覆蓋3個級別，包含7個點，相關系數大于0.99，均滿足GB/T 27404-2008要求。頂空進樣達到與全自動直接進樣一致的良好線性，滿足準確定量的要求。

表1 標準曲線線性關系

圖6 頂空進樣標準曲線 圖7 直接進樣標準曲線

2.4.2 加標回收率

根據所配置的甲醇標準儲備液，選擇低度數的普通白酒作為加標試樣，對頂空進樣和直接進樣分別進行4個不同質量濃度的進樣，依次測定并計算其加標回收率，數據和結果見表2。頂空進樣回收率為95.12%～100.92%，直接進樣回收率為99.54%～102.62%，兩種進樣方式都取得較好的加標回收率，滿足GB/T 27404-2008對回收率的要求。因此靜態頂空進樣同樣可準確進行酒中甲醇的測定和質量控制。

表2 頂空進樣和直接進樣回收率結果

2.4.3 精密度

頂空進樣和直接進樣分別對每個質量濃度重復測定6次，計算得各相對標準偏差見表3。頂空進樣RSD值為0.277%～0.511%，直接進樣RSD值為0.127%～0.338%，兩種進樣方式都取得較好的精密度，滿足GB/T 27404-2008對精密度的要求。靜態頂空進樣同樣取得較小的偏差，可進行酒中甲醇的準確測定。

表3 頂空進樣和直接進樣精密度測試結果

2.4.4 測定低限

根據所配甲醇儲備液，直接進樣對加標量為 5.008 μg/mL 的6個加標試樣連續進樣，平均加標回收率為101.018%，相對標準偏差為1.825%。頂空進樣對加標量為 5.06 μg/mL 的6個加標試樣連續進樣，平均加標回收率為94.097%，相對標準偏差為2.239%。兩種進樣方式加標回收率高且穩定，相對標準偏差較小，精密度較高，因此以 5 μg/mL 作為酒中甲醇測定的定量限。

2.4.5 準確度

頂空進樣和直接進樣分別對白酒和紅酒兩種質控樣品進行測定，測定結果和誤差見表4。對白酒質控樣品，頂空進樣和直接進樣測定結果都較接近特性值，并都取得了較高準確度。對紅酒質控樣品，頂空進樣測定結果相對高于直接進樣，準確度相對比直接進樣更高，絕對誤差更小。因此，靜態頂空進樣對酒中甲醇的測定效果良好，特別是，對于紅酒不經蒸餾可直接吸取原樣進行進樣測定，在一定程度上避免了因蒸餾造成甲醇的損失，可靠性比直接進樣高。

表4 頂空進樣和直接進樣對質控樣品測定的結果

2.4.6 樣品測定結果

頂空進樣和直接進樣分別對市售2份白葡萄酒、2份紅葡萄酒、1份高粱白酒、1份清香型白酒、3份醬香型白酒中甲醇進行測定，同一試樣采用雙樣連續兩次進樣，測定結果平均值見表5。從表5來看，通過頂空進樣測得葡萄酒的甲醇含量，特別是紅葡萄酒，明顯比蒸餾后全自動直接進樣測得的甲醇含量高。這說明頂空進樣法測定葡萄酒比直接進樣法具有更高可靠性，直接移取原樣測定，在一定程度上避免了因蒸餾、冷卻等前處理過程造成甲醇的損失。從甲醇出峰來看，兩種進樣方式甲醇峰形都較好且無干擾。高粱白酒兩種進樣方法測得絕對差值比上算術平均值1.602%<10%、清香型白酒兩種進樣方法測得絕對差值比上算術平均值0.161%<10%。可見，對于普通白酒，兩種進樣方法結果偏差較小，而且兩種進樣方式甲醇峰形都較好且無干擾，所以兩種進樣方式皆適宜普通白酒甲醇的測定。對于醬香型白酒(以本實驗所選用的3種為例)，通過頂空進樣法測得甲醇色譜峰尖銳、對稱，無拖尾，可進行準確定性定量分析(見圖8)。通過直接進樣，在經過一系列色譜條件優化后，雖然使甲醇峰得到了有效的分離，但是均出現了嚴重的拖尾(見圖9)。通過軟件自動積分，由于包含了拖尾部分，定量計算得甲醇含量值明顯高于頂空進樣法測得值；通過手動積分，去除拖尾部分，得到甲醇含量值與頂空進樣法測得值保持一致，偏差較小。說明對于甲醇峰難分離的醬香型白酒選擇靜態頂空法更合適，特別是需要準確定量分析甲醇的時候。綜上，選擇靜態頂空進樣法測定酒中甲醇含量比全自動直接進樣法更簡化、準確。

表5 頂空進樣和直接進樣分別對不同試樣測定結果

圖8 3種醬香型白酒頂空進樣的甲醇色譜峰

圖9 3種醬香型白酒直接進樣的甲醇色譜峰自動積分與手動積分

2.5 儀器比對驗證

采用賽默飛科技世爾的頂空-氣相色譜儀(頂空進樣器型號：TRIPLUS 300；氣相色譜儀型號：TRACE 1310)；色譜柱：TG-WAX MS 60 m×0.250 mm×0.25 μm)，對酒中甲醇通過靜態頂空進樣和全自動直接進樣測定進行儀器對比驗證。①方法：進樣口溫度、程序升溫與檢測器溫度保持與上述島津的一致，依然須控制低進樣量才能使目標峰完整、良好地分離開。對于直接進樣，本實驗選擇分流比20∶1，進樣量 0.4 μL，載氣流量 1.2 mL/min 效果最佳；對于頂空進樣平衡溫度、時間與上述島津的一致，由于儀器本身存在的差異，這里選擇進樣量 1 mL，分流比100∶1，載氣流量 1.0 mL/min 效果最佳。②數據結果：兩種進樣方式都得到了較好的標準曲線，本實驗重點對比了兩臺不同廠家儀器和不同色譜柱對幾種紅酒和3種醬香型白酒中甲醇測定的結果。對于紅酒，兩種進樣方式甲醇出峰良好，頂空進樣測得甲醇含量比蒸餾后直接進樣測得的甲醇含量高，與使用島津氣相色譜儀測得結果一致；對于3種醬香型白酒，直接進樣方式在優化保證甲醇峰分離開的前提下，得到的甲醇峰依然拖尾嚴重，而頂空進樣法得到的甲醇峰分離良好，測得結果與使用島津氣相色譜儀測得結果一致。

3 結論

本方法采用靜態頂空進樣與全自動直接進樣兩種方式對不同酒中甲醇含量的測定比較，通過對色譜柱的選擇、色譜條件的優化、頂空進樣條件的確定、標準曲線、樣品加標回收率、紅酒和白酒質控樣品準確度、方法精密度、不同樣品酒中甲醇測定結果等方面進行探究和對比。采用頂空進樣法改進酒中甲醇的測定，標準曲線線性相關系數較高，樣品加標回收率和精密度高，且符合GB/T 27404-2008。在樣品的測定中，一方面減少了GB 5009.266-2016《食品安全國家標準 食品中甲醇的測定》中顏色較深的發酵酒及其配制酒前處理蒸餾、定容等繁瑣過程，避免了因蒸餾造成的甲醇損失，同時也減少了對色譜的污染；另一方面對于甲醇難分離的醬香型白酒，頂空進樣甲醇峰分離效果比直接進樣分離更好，體現在峰形完整良好上，定性定量更準確，而且頂空進樣也適用其它型白酒中甲醇的測定并取得較好結果。另外，由于頂空進樣直接取樣裝瓶上機，前處理過程簡單、快捷，適合批量檢測。所以，靜態頂空-氣相色譜法可適用于高效、準確地檢測各類酒中甲醇含量，特別是對于紅酒和醬香型白酒更是優勢明顯，準確可靠。