初治病原學陽性肺結核患者細菌學與免疫學指標動態變化分析

田麗麗 丁北川 王嫩寒 王楠 張潔 楊新宇 任怡宣 趙琰楓 陳雙雙 羅萍 王秀雙 劉青 代小偉 李傳友

研究證實肺結核的發生發展與機體免疫功能密切相關，尤其是細胞免疫在肺結核的發病機制中起著重要作用[1-3]。在活動性肺結核治療過程中，γ-干擾素濃度隨時間變化的價值尚不明確[4]。早在1976年Genoud A.等[5]研究顯示結核病患者細胞和體液免疫之間有很好的相關性，說明在結核病發生發展過程中體液免疫亦發揮著輔助作用[3，6-8]，國內梁冰等[9]研究亦發現結核病患者PPD試驗和結核抗體水平之間存在著較高的一致性。為了進一步確定這些指標在結核病診斷和療效判斷方面的意義，本研究分析了本所門診收治的34例肺結核患者的資料，于治療不同階段行T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片+培養檢測，評價其細菌學與免疫學指標動態變化情況及其臨床意義。

資料和方法

一、 一般資料

研究選取2020年8月-2021年5月北京結核病控制研究與防治所門診收治的34例初診病原學陽性且利福平敏感的肺結核患者(課題推進期間不間斷聯系了73名患者，部分患者不同意簽署知情同意書；部分患者在治療過程中因為依從性差而中斷監測；部分患者由于突發的新冠疫情原因，治療途中離開北京而中斷監測，因此最終完成規劃監測的患者只有34例)，所有納入的肺結核病例均符合我國肺結核診斷標準(WS288—2017)[10]中的確診病例；治療方案參照“肺結核診斷和治療指南”[11]中規定的化療方案；分別于治療前、治療2月、治療6月三個階段均行T-SPOT.TB、結核抗體、痰涂片+培養檢測。34例肺結核患者中，男性24例(70.59%)，女性10例(29.41%)；年齡21～70歲，平均年齡(44.47±17.84)歲。所有患者均排除肺部其他疾病、糖尿病、肝炎、腎臟病及免疫性疾病，未用過皮質類固醇激素的患者。本研究經本所倫理委員會批準(批件號202002)，且征得患者同意并簽署知情同意書。

二、檢測方法

1 T-SPOT.TB檢測：采用結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(TS-SPOT.TB試劑盒，北京同生時代生物技術有限公司)。從全血樣本中分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個預包被抗γ干擾素抗體的孔中加入2.5×105個PBMC，分別與早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)和Rv3615c共同孵育16～20 h，使用讀板儀對斑點進行計數。陽性判斷值：(1)陰性對照孔斑點數≤10，超過10個視為無效檢測樣本；(2)陽性對照孔斑點數應當≥20個或布滿整個孔底，如果斑點數<20個時，且通過檢測孔與陰性對照孔判定結果為陽性，則視為陽性結果，否則為無效樣本； (3)當陽性對照孔斑點數≥20個時，T-N等于5、6、7時，此結果認為是灰區，應當結合其他臨床診斷信息進行判斷，必要時重復實驗。

2 結核抗體檢測：結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)(MP Diagnostics ASSURE? TB Rapid Test)購自MP生物醫學亞太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25μl至檢測孔內，加3滴緩沖液于橢圓孔，直至樣本前沿到達藍色指示線后，即刻拉下分離片，加1滴緩沖液于加樣孔，水平放置，15 min內判讀結果。結果判讀標準：(1)如果在測試線處(T)和質控線處(C)出現紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體為陽性，任何深度條帶均應判作陽性；(2)如果視窗內僅質控線處(C)顯示紫紅色條帶，則結核分枝桿菌抗體陰性；(3)如果質控線處(C)條帶未顯示，則結果無效。

3 GeneXpert法：GeneXpert MTB/RIF核酸檢測儀及試劑由美國 Cepheid公司生產。檢測嚴格按照說明書操作，取 1 mL痰標本，加入2 mL標本處理液，震蕩混勻，靜置 15 min后，吸取2 mL液化標本于反應盒內，將加好 標本的反應試劑盒放到檢測儀內，開始自動檢測，反應結束后在檢測系統窗口下直接觀察測試結果。

4 痰涂片+培養：萋-尼抗酸染色液、酸性羅氏培養基由珠海貝索生物技術有限公司提供。痰涂片抗酸染色鏡檢采用萋-尼染色，按照《結核病實驗室檢驗規程》[12](簡稱《規程》)進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢；分枝桿菌固體培養采用簡單法，按照《規程》進行分枝桿菌分離培養檢查。痰涂片、培養或GeneXpert任何1項結果陽性即判斷病原學陽性。

三、質量控制

T-SPOT.TB檢測質量控制：按照試劑盒內提供的陽性對照和陰性對照，與樣品同時檢測，確保實驗結果的準確性；結核抗體檢測質量控制：根據檢測反應板質控線條帶顯示判斷，嚴格按照試劑盒檢測規程以保證檢測準確性；GeneXpert法質量控制：每個檢測方法定期進行樣品處理質量控制(SPC)和探針質量控制(PCC)，以確保樣品經過正確處理和探針符合指定的接受標準，保證檢測系統合格；痰涂片與培養質量控制：按照《規程》要求，進行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養的室內質量控制及室間質量評價。

四、統計學處理

采用SPSS 16.0、GraphPad Prism8.0.2軟件對數據進行處理。計數資料采用“百分率(%)”表示，不同階段結果比較分析采用Fisher精確檢驗；計量資料不同階段結果比較分析采用配對t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、4種指標治療前陽性檢出率的比較

34例菌陽肺結核中，治療前初次檢測痰涂片+培養陽性29例，陽性檢出率為85.29%；GeneXpert檢測陽性33例，陽性檢出率為97.06%；γ-干擾素檢測陽性34例，陽性檢出率為100%；結核抗體檢測陽性26例，陽性檢出率為76.47%(見表1)。4種檢測指標中GeneXpert、γ-干擾素檢測陽性檢出率與結核抗體陽性檢出率差異有統計學意義(Fisher精確檢驗P值=0.027，0.005，P<0.05)。

表1 4種指標陽性檢出率比較

二、3種檢測指標不同時間段(治療前、治療2月、治療6月)檢測結果比較

29例痰涂片+培養陽性的肺結核患者，治療2月陰轉26例，陰轉率89.66%(26/29)；治療6月全部陰轉，陰轉率100%(29/29)。其中治療2月未陰轉的3例患者為涂片陽性，培養結果均為陰性。治療前與治療2月、治療6月痰涂片+培養檢測結果差異有統計學意義(Fisher精確檢驗均P<0.001)，治療2月與治療6月痰涂片+培養檢測結果差異無統計學意義(Fisher精確檢驗P值=0.239，P>0.05)(見表2)。

表2 3種檢測指標治療前、治療2月、治療6月檢測結果比較

34例γ-干擾素釋放試驗陽性的肺結核患者，治療2月γ-干擾素檢測陰轉2例，陰轉率5.88%(2/34)；治療6月陰轉8例，陰轉率23.53%(8/34)。治療前與治療6月γ-干擾素釋放試驗檢測結果差異有統計學意義(Fisher精確檢驗P值=0.005，P<0.05)，治療前與治療2月、治療2月與治療6月γ-干擾素釋放試驗檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

26例結核抗體陽性的肺結核患者中，治療2月結核抗體陰轉3例，陰轉率11.54%(3/26)；治療6月結核抗體陰轉7例，陰轉率26.92%(7/26)。治療前與治療6月、治療前與治療2月、治療2月與治療6月抗體檢測結果差異均無統計學意義(Fisher精確檢驗P值=0.123，0.590，0.454，P>0.05)(見表2)。

三、γ-干擾素釋放試驗結核特異性抗原與植物血凝素(TBAg/PHA)比值在不同時間段(治療前、治療2月、治療6月)動態檢測結果比較

17例患者治療2月TBAg/PHA比值相比較于治療前下降超過50%，10例患者TBAg/PHA比值下降低于50%，7例患者TBAg/PHA比值比治療前較高，但低于50%；28例患者治療6月TBAg/PHA比值下降超過50%，4例TBAg/PHA比值下降低于50%，2例TBAg/PHA比值治療前與治療6月變化不大。治療前、治療6月TBAg/PHA比值分別為0.473±0.677、0.129±0.199(t=3.656，P=0.001，P<0.05)；治療前、治療2月后 TBAg/PHA比值分別為0.473±0.677、 0.261±0.483(t=3.428，P=0.002，P<0.05)；治療2月、治療6月TBAg/PHA比值分別為0.261±0.483、0.130±0.199(t=2.277，P=0.029，P<0.05)，治療前、治療2月、治療6月TBAg/PHA比值差異均具有統計學意義(見圖1)。

圖1 結核特異性抗原與植物血凝素(TBAg/PHA)比值在抗結核治療不同時間段動態變化折線圖

討 論

在研究結核病免疫的過程中，普遍認為以細胞免疫為主，體液免疫為輔[3,25]。而隨著對結核病的深入研究，越來越多的研究結果表明，體液免疫在結核病發生發展中發揮重要作用，尤其是結核抗體IgG 更是明顯提高，在機體免疫保護中發揮重要作用；結核抗體檢測呈陽性反應，提示Th2型免疫應答增強，患者可能存在組織損傷和抗結核免疫力下降[3,7，26]。目前，對于結核抗體檢測的意義各家看法不一，普遍認為與其他檢測聯合可以提高檢測意義[27-29]，造成陽性率相差較大的緣由，與試劑如抗原等，還與儲存、人員技術水平等有關。本研究對34例菌陽肺結核病患者外周血分別于0, 2, 6月行結核抗體檢測，首診陽性檢出率達76.47%，2月陰轉率11.54%；6月陰轉率26.92%；治療前、治療2月、治療6月抗體檢測結果差異均無統計學意義(P>0.05)。顯示了其在菌陽肺結核患者中陽性檢出率相對較高，但陰轉率較低，可能與菌陽肺結核的組織損傷程度相對要重，組織修復相對要慢、體液免疫恢復更要慢[16]有關，因此結核抗體在結核輔助診斷中起到一定的作用，但不能很好地反映治療療效情況。

本文34例菌陽肺結核患者痰涂片+培養檢出29例陽性，陽性檢出率達85.29%，2月陰轉率達89.66%；另3例雖然痰涂片陽性，但培養結果均為陰性，證實2月末排出為無活性的結核分枝桿菌，且此3例患者治療2月γ-干擾素釋放試驗TBAg/PHA比值較治療前均下降；治療6月29例全部陰轉，陰轉率達100%，說明在菌陽患者中痰涂片+培養結果能夠很好的反應病情程度與治療療效；但痰涂片+培養在所有肺結核病檢出中敏感性較低，因此雖為肺結核病檢出的金標準，但有很大程度的限制性[27]。Genexpert MTB/RIF(簡稱GeneXpert)為近幾年發展起來的新型快速結核分枝桿菌特異性分子生物檢測技術，基于PCR基礎，同時能檢測是否為利福平敏感/耐藥株。此技術直接檢測標本為痰液，2 h出結果，敏感性較高，因此目前廣泛應用于臨床[30-31]，本研究采用GeneXpert分子檢測方法篩選菌陽且利福平敏感活動性肺結核患者34例，33例陽性，陽性率高達97.06%。

綜上所述，通過對34例初治利福平敏感肺結核患者動態檢測觀察患者免疫應答動態變化趨勢與細菌檢測結果分析，顯示各項指標對活動性肺結核患者的陽性檢出率各不相同；在有效抗結核治療6個月后，肺結核患者的IFN-γ水平顯著降低，尤其是在治療的最初2個月；結核抗體雖在結核診斷中起到輔助診斷的作用，但陰轉較低，不能很好地反映治療療效情況；在菌陽患者中痰涂片+培養亦能夠很好的反應治療情況。在治療過程中對細菌學指標與免疫學指標動態變化分析可能為監測肺結核患者的病情與治療療效反應提供一定的價值，可供臨床參考與借鑒。

本研究僅收集到部分患者治療過程中的影像學資料，無法用于統計分析，此為本文不足之一；從已收集到的影像學資料來看，CT或X線影像學病灶的吸收好轉和免疫學指標情況一般滯后于臨床癥狀、體征，可能與免疫損傷后恢復慢和不一致有關[16]。本文另一不足之處是收集觀察樣本較少，可能引起結果偏倚，影響數據統計；未同時做呼吸道其他疾病或菌陰肺結核的對照實驗亦是本文不足之處。在以后的研究中，我們將進一步完善不足，嘗試進一步研究其在菌陰肺結核的輔助診斷與治療中的指導價值。