量子點標記免疫分析技術在食品安全檢測中的應用現狀

蘇丹，吳天琪，楊雨，李曉峰，王劍輝，郝建雄，高山，胡高爽

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000）

靈敏、可靠的快速檢測技術是保障食品安全的主要環節，也是近年來研究難點和熱點[1]。目前，食品安全檢測中常用的檢測方法是儀器分析法，包括氣相色譜法（gas chromatography，GC）[2]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[3]、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[4]、液相色譜-質譜聯用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[5]等。盡管這些方法在食品安全檢測過程中表現出靈敏度高、準確性好等優點，然而其需要復雜的前處理過程，包括樣品的提取和濃縮，并且檢測過程中需要專業的操作人員來實現繁瑣的檢測步驟，復雜的高精度儀器設備也無法滿足現場快速檢測的需求[6]。

基于抗原抗體特異性識別和可逆性結合反應的免疫分析技術興起于20世紀70年代，是適用于特異性抗原、半抗原或抗體的快速檢測方法。該方法具有快速、特異性好、高通量、方便、低成本等特點，已被廣泛應用于醫學、環境科學、生物、化學、食品安全等領域[7-9]。然而，傳統的免疫分析技術以酶或者膠體金等作為標記材料，制作工藝和免疫反應程度的不同都會導致酶或者膠體金等顯色效果受到影響，進而限制了方法靈敏度的進一步提高[10-12]。

量子點（quantum dots，QDs）是由元素周期表主族Ⅱ與副主族 VI（如 CdSe，CdTe，CdS 和 ZnSe）或主族Ⅲ與副主族Ⅴ（InP和InAs）元素組成的一種直徑在1 nm～20 nm，由100個～1 000個原子按某種方式排列形成的新型熒光納米材料[13]。QDs的熒光強度比傳統染料高100倍左右，且光化學穩定性好，用于標記探針時可提高方法的靈敏度。此外QDs具有優良的生物兼容性，其表面經過化學修飾后可與抗體、核酸等大分子連接后不改變其生物性質[14]。本文針對QDs標記免疫分析技術在食品檢測領域的應用現狀進行綜述，包括基于QDs的熒光免疫分析技術、免疫層析技術、免疫親和凝膠檢測柱、免疫傳感器等，以期為促進免疫分析技術在食品檢測中的應用提供理論支持。

1 量子點的制備方法

迄今研究者們建立了多種QDs的制備方法，大體分為兩種，物理方法和化學方法，其主要以化學方法為主[15]。化學方法又可以細分為兩類，分別為有機溶劑途徑和水相途徑。從有機溶劑途徑中制備的QDs具有較高的熒光量子產率、較窄的熒光半峰寬、較好的單分散性和穩定性，但制備時存在試驗成本高、操作安全性低、試劑毒性強等諸多缺點[16]。水相中制備QDs具有試劑無毒、操作簡單、環境友好、重現性高等優點[17]。同時，水相制備的QDs具有優越的生物相容性，可以直接應用于生物體系。然而，除CdTe、HgTe外，大部分水相制備的QDs的發光性能較差，通常需要經過如選擇性沉淀、紫外光照、改變QDs結構等手段提高熒光量子產率[18-19]。

1.1 有機溶劑中量子點的制備

在有機溶劑中制備QDs，主要是通過膠體化學法在有機體系中制備，該方法又稱為有機金屬法，即用金屬有機化合物在具有配位性質的有機溶劑環境中合成納米晶體[20]。1993年，Murray等[21]采用金屬有機法首次合成了高質量的CdSe QDs，該方法主要是利用二甲基鎘[Cd（CH3）2]和三辛基硒膦（trioctylphosphine selenide，TOPSe）前驅體迅速加入到三正辛基氧化膦（tri-n-octylphosphine oxide，TOPO）溶劑中，通入氮氣保護，并置于230℃～260℃的高溫條件下反應制得單分散的CdSe QDs。這種方法雖然重復性好，得到的CdSe QDs熒光性質穩定，但是由于在合成過程中易爆炸，并且產生劇毒，在室溫條件下不穩定，因此限制了這一方法的推廣。Liu等[22]通過有機溶劑法制備了石墨烯量子點（graphene quantum dots，GQDs），結果表明，具有雙鍵、苯環和雙親水性基團的有機溶劑不需要添加催化劑或分子前驅物即可直接分解為GQDs，合成的GQDs具有較小的尺寸分布（＜3 nm）和親水表面基團，反應條件溫和，操作簡單易行，安全性和生物相容性良好等優點，使其適用于工業生產中。有機合成法合成的QDs量子效率高，分散性好，熒光半峰寬窄[23]。到目前為止，在高溫有機溶劑環境中合成QDs仍然是制備高質量QDs的主要手段。

1.2 水相中量子點的制備

盡管在高溫有機溶劑中可以合成高質量的單分散、高熒光量子產率的QDs，但這種方法得到的QDs不能直接分散于水中，因而限制了QDs在水環境以及生物體系中的直接應用，且存在環境污染和成本高等問題[24]。為了克服這些問題，研究者又開發了直接在水溶液中合成QDs的方法。水相合成法是以水作為溶劑，巰基化合物作為穩定劑，金屬無機鹽作為原料，在較低溫度下制備水溶性QDs的常用方法，目前采用該方法合成QDs已成為一個研究的熱點[25]。Mrad等[26]以AgNO3、In（NO3）3、Zn（OAc）2、Na2S 為前體，3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，3-MPA）為配體，通過簡單的水相合成法制備出了高熒光和顏色可調的（AgInS2）x（ZnS）1-xQDs（AIZS QDs），使 AIZS QDs作為無鎘熒光探針在生物成像或食品檢測等多種應用中具有很高的潛力。于此同時，QDs在水相合成中也得到了廣泛的推廣，CdSe[27]、CdTe[28]、ZnSe[29]、CdTe/CdS[30]等巰基化合物穩定的水溶性QDs都已被成功合成。但是利用水相合成QDs的反應溫度低，使得粒子的生長速度較慢，顆粒表面缺陷增加，導致發光效率不高。盡管如此，與有機法對比，水相法合成條件更加溫和，易控制，操作簡單，成本低，合成的QDs水溶性、熱穩定性好，適合大規模生產。

2 基于量子點標記的免疫分析技術在食品安全檢測中的應用

2.1 基于量子點標記的熒光免疫分析技術

熒光免疫分析技術（fluorescent-linked immunosorbent assay，FLISA）是將抗原抗體結合的特異性與熒光標記技術的靈敏性結合，并對抗原或抗體進行定量或定性分析。QDs標記熒光免疫分析技術是將QDs作為熒光材料與抗體或抗原偶聯，建立的方法比傳統的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）靈敏度更高，操作更簡便。

Zhang等[31]利用重組DNA技術和蛋白質技術制備新型的抗黃曲霉毒素 B1（anti-aflatoxin B1，AFB1）單克隆抗體，并采用水相合成法合成了新型的CdTe/CdS/ZnS QDs，構建了基于QDs標記的熒光免疫分析技術，并用于檢測谷物樣品中的AFB1，該方法谷物樣品中的檢測限為0.01 ng/mL，線性范圍為0.08 ng/mL～1.97 ng/mL，該研究為食品安全檢測和基因工程抗體的改良提供了指導。此外，研究者們針對QDs標記FLISA檢測多殘留物質的研究也進行了報道。Le等[32]建立了基于QDs的雙標記直接競爭熒光免疫分析法（direct competitive fluorescent-linked immunosorbent assay，dc-FLISA），并用于動物組織中多酚代謝物（quinoxaline-2-carboxylic acid，QCA）和喹啉多酚代謝物（methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA） 的快速檢測，實現了在微量滴度板的一個孔中同時檢測MQCA和QCA的目的。方法針對QCA和MQCA的檢出限分別為0.05 ng/mL和0.07 ng/mL，加樣回收率分別為81.5%～98.2%（QCA）和 84.2%～95.7%（MQCA）。Song等[33]將牛奶中的鏈霉素（streptomycin，SM）、四環素（tetracycline，TC）和青霉素 G（penicillin G，PC-G）抗體與具有不同發射波長（520、565 nm和610 nm）的QDs偶聯進行直接競爭熒光免疫分析。結果顯示，該方法針對3種物質的檢測限為5 pg/mL，線性范圍分別為0.01 ng/mL～25 ng/mL、0.01 ng/mL～25 ng/mL和 0.01 ng/mL～10 ng/mL，該方法表現出操作簡單、靈敏性好、高通量等優點，對多種殘留物的檢測具有廣泛的應用前景。Zhu等[34]用熒光素酰胺功能化的CdSe/ZnS QDs作為熒光探針，建立了快速檢測四溴雙酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）的比率熒光免疫分析法，在相同的激發波長（490 nm）下，測定出兩種高分辨波長熒光強度比值（OD650nm/OD522nm）的變化，從而實現對TBBPA的檢測，在優化條件下，該方法的檢出限為0.118μg/L，線性范圍為0.34 μg/L～45.34 μg/L，并且比傳統的ELISA低一個數量級，為快速、靈敏地分析環境中的新興污染物提供了新思路。

Zhang等[35]以CdSe/ZnS QDs為熒光標記物，建立了檢測火鍋湯底中嗎啡含量的FLISA。在最佳條件下，該方法的檢出限為2.7×10-4mg/L。然而，由于CdSe/ZnS QDs的毒性，限制了基于QDs的FLISA技術在實際生產中的應用，因此，開發無毒、環保的FLISA具有非常重要的研究意義。碳量子點（carbon quantum dots，C-Dots）作為新型熒光納米粒子，以其優異的光穩定性、低毒性和在水溶液中的溶解性等顯著優勢，在生物化學和生物科學領域引起了廣泛關注。Zhang等[36]采用一步水熱法制備了具有良好穩定性且呈藍色熒光的C-Dots（發射波長為440 nm，激發波長為350 nm），在此基礎上建立了一種靈敏、環境友好的基于C-Dots的檢測嗎啡的熒光免疫分析法（carbon quantum dotsbased fluorescence immunoassay，C-Dots-FLISA），用于定量檢測火鍋湯底中的嗎啡含量，在最佳條件下，該方法的線性范圍為3.2×10-4mg/L～10 mg/L（R2=0.992），檢出限為3×10-4mg/L。

2.2 基于量子點標記免疫層析技術

免疫層析技術是建立在層析技術和抗原-抗體特異性免疫反應基礎上的一項新興免疫檢測技術，具有靈敏度高、快速、簡單等特點，適合現場及大量樣品的檢測。與常規的膠體金免疫層析試紙條相比，QDs熒光試紙條具有更高的檢測靈敏度和更強的特異性，并且可以實現目的分子的定量分析[37]。

Wu 等[38]采用 CdSe/ZnS（核/殼）QDs標記抗體，并建立了基于QDs的熒光橫向流動試紙條（fluorescence lateral flow test strip，FLFTS），實現了草莓中苯并硫代蟲甾醇的快速檢測，樣品檢測限為25 μg/L。該試驗采用目視檢測方法結合凝膠成像儀形成定量檢測，為構建直觀、特異、靈敏、快速檢測苯并硫代菌素方法提供了新思路。依據QDs發射波長窄等特點，為多目標物快速檢測方法的構建提供了可能性，Hou等[39]利用發射波長為615 nm的QDs標記抗體，構建了同時檢測伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的免疫層析技術。該方法針對3種物質的IC50分別為12.66、12.66、0.87 ng/mL。結果表明，利用QDs修飾羧基官能團，有利于抗體偶聯，且顯著提高了試紙條的靈敏度。

近年來，科研工作者探究了不同納米材料作為信號標記物應用于免疫層析技術的優缺點，以其篩選最佳的信號標記材料。Li等[40]用膠體金、QDs和聚苯乙烯微球（polystyrene microsphere，PM）作為標記物，構建了3種橫向流動免疫層析法（lateral flow immunochromatographic assays，ICAs），用于檢測玉米樣品中的ZEN。結果表明，基于膠體金ICAs的檢測限（limit of detection，LOD）為 10 μg/L，基于 QDs和聚苯乙烯微球的ICAs的LOD均為1 μg/L，加標樣品和谷物的含量分別為 60、6、6 μg/kg。因此，基于 QDs的 ICAs能夠作為ZEN快速、高特異性、高靈敏度檢測的有效工具。此外，Hu等[41]利用膠體金、QDs和上轉換納米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）標記抗體作為信號探針，建立了3種新型的免疫層析方法，并實現了牛奶中諾氟沙星（norfloxacin，NOR）的檢測。結果顯示，與傳統膠體金試劑相比，使用QDs和UCNPs作為信號探針在標準溶液和牛奶樣品中均表現出更高的靈敏度。因此，利用QDs和UCNPs作為熒光信號探針更適用于復雜樣品中的低濃度小分子快速、靈敏、直觀的現場檢測。Sheng等[42]利用染色聚合物微球和QDs代替傳統的酶或膠體金標記抗體構建了新型的免疫層析技術，并用于動物組織和牛奶中的恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）的快速檢測。該方法的目測方法檢測限均為 1 μg/L，動物組織中檢測限為 5 μg/kg，牛奶中檢測限為10 μg/L，且檢測過程（包括樣品預處理和分析）只需20 min，遠遠低于商業酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 的檢測時間（120 min）。

熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一種對于相互靠近的供體與受體通過偶極子-偶極子相互作用而產生的非輻射性的過程，被廣泛地應用于生物檢測領域。FRET的發生需要滿足以下兩個條件，第一，供體的發射波長與受體的吸收波長重疊；第二，兩者之間的距離小于10 nm。在許多生物反應，包括DNA雜交、抗原-抗體免疫反應、酶催化的分解反應等，發生的條件都滿足上述距離的要求。因此，基于FRET的免疫分析技術可作為分析檢測的有用工具。Li等[43]采用檸檬酸和乙二胺為起始物，利用一步法制備氮摻雜碳點，并根據熒光共振能量轉移的原理與抗原抗體發生特異性反應，構建了基于碳點（carbon dot，CD）/銀納米顆粒（silver nanoparticle，Ag－NP）熒光猝滅體系和QDs/金納米顆粒（gold nanoparticle，AuNP）熒光猝滅體系的側流免疫層析法（fluorescence quenching lateral flow immunochromatographic assays，FLFIAs），并成功實現了動物源性食品中ENR的快速檢測。結果表明，基于CD/AgNP的FLFIA（CFLFIA）的視覺臨界值為0.1 μg/L，基于QD/AuNP的FLFIA（Q-FLFIA）的視覺臨界值為 0.25 μg/L，結果比基于AgNP的傳統側流免疫層析（lateral flow immunochromatographic assays，LFIA）法的臨界值（5 μg/L）和基于AuNP的 LFIA 的臨界值（10 μg/L）更加靈敏，可作為ENR快速檢測的有效方法。

然而，上述免疫層析方法存在半定量的缺陷，為了實現免疫層析技術定量快速檢測目標物的目的。Wu等[44]借助熒光閱讀器構建了基于QDs的熒光免疫層析定量檢測方法，實現了水稻樣品中的三唑磷的快速檢測。該方法利用熒光強度測試線和控制線的比值定量測定三唑磷殘留量。此方法在0.49 ng/mL～250 ng/mL內對三唑磷具有良好的線性檢測能力，且半抑制濃度為6.97 ng/mL。

2.3 基于量子點標記免疫親和凝膠檢測柱

免疫親和凝膠檢測柱（immunoaffinily chromatography test assay，IATC）是一種基于免疫親和檢測法發展起來的可視化快速檢測方法[45-46]，具有操作簡便，檢測時間短，結果易于判斷，非常適用于現場檢測等特點[47]。傳統的免疫親和凝膠檢測柱利用酶催化顯色作為信號輸出模式，方法的靈敏度受到一定的限制。利用QDs的熒光信號作為新型的信號輸出模式，為提高免疫親和凝膠檢測柱的靈敏度，簡化樣品處理步驟提供了新思路。

賈春蕊[48]采用活化酯法將QDs作為示蹤物標記鄰苯二甲酸二甲酯包被抗原，通過觀察熒光強度的變化判定檢測結果，試驗方法檢出限為30 μg/L，樣品檢測限為30μg/L～150 μg/L。該檢測柱與傳統的免疫親和凝膠檢測柱相比，特異性好，靈敏度高，且試驗所采用的樣品前處理步驟簡單，省去了加入底物顯色的步驟，為免疫親和凝膠檢測柱直接檢測食品中的殘留物質提供了參考。基于熒光共振能量轉移的原理，研究學者也構建一些新型的基于QDs熒光淬滅的免疫親和凝膠檢測柱方法，用于食品中危害物的快速檢測分析。Chen等[49]利用ZnCdSe/ZnS QDs與孔雀石綠（malachite green，MG）或結晶紫（crystal violet，CV）之間的熒光共振能量轉移以及多克隆抗體對分析物的特異性吸附，構建了一種同時檢測水產品中殘留的MG和CV的可視化熒光免疫親和凝膠檢測柱（fluorescence quenching immunoaffinitytestcolumn，FQ-ITC），試驗中 ZnCdSe/ZnS QDs最大發射波長為625 nm，該方法采用的FQ-ITC成功應用于草魚、條紋鱸魚、鯉魚和對蝦的檢測，且實際樣品的檢出限為2 μg/kg。此外，胡高爽等[50]利用綠色發光QDs構建了一種針對番茄醬中羅丹明B快速檢測的熒光猝滅免疫親和凝膠柱，該方法針對番茄醬樣品中羅丹明B的檢測限為5.0 μg/kg，并且與HPLC方法測定的結果表現出很好的一致性，可以滿足番茄醬中羅丹明B的現場快速檢測的要求。

2.4 基于量子點標記免疫傳感器

免疫傳感器是一種免疫檢測技術和傳感技術相結合的一種新型生物傳感器技術，從結構來看主要包括敏感原件、換能器和信號數據處理器三部分，每部分各自均有特定的功能，工作時它們互相協作和配合，共同達到分析檢測的目的[51]。基于QDs標記的免疫傳感器通過抗原與抗體特異性識別作用來改變檢測信號的傳感平臺，因其具有靈活度高、穩定性強、敏感性強等特點在食品安全檢測中被廣泛應用[52]。

Mehta等[53]用GQDs對絲網印刷碳電極進行修飾，然后用2-氨基苯胺對其進行電化學修飾，得到了-NH2官能團，隨后處理過的電極與抗對硫磷抗體結合，成功檢測出了不同食物、水和土壤樣品中殘留的對硫磷。該方法的線性范圍為0.01 ng/L～106ng/L，檢測限為46 pg/L。該試驗所提出的電化學免疫傳感器具有高靈敏度、廣泛性和便攜性，且絲網印刷電極具有樣本量小、便攜性好、成本效益高、電位范圍寬等優點，為環境和食品樣品中檢測其他農藥殘留物質提供了參考。Yu等[54]用核殼（CdSe-SiO2）納米材料制作了雙發射QDs，并嵌入CdTe QDs作為熒光探針，與具有傳統免疫分析的3D打印緊湊型設備結合，開發了一種低成本、高靈敏度的檢測平臺，用于定量分析雞胸肉樣品中的金剛烷胺（amantadine，AMD）殘留量，該試驗由葡萄糖氧化酶催化葡萄糖產生H2O2，再與QDs發生雜化反應產生多色響應的視覺效果，通過檢測QDs的比率熒光信號，并使用3D打印設備作為定量讀數系統。該方法目視檢測限（limit of detection，LOD）為 0.37 ng/mL，采用小型儀器設備的LOD為0.057 ng/mL。由于其存在便攜性、直接視覺檢測、高靈敏度和成本效益方面的優勢，因此，免疫傳感器在沒有實驗室或昂貴的基礎設施的領域中具有巨大的應用潛力。

2.5 量子點標記技術與ELISA相結合

ELISA是將抗原、抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合，通過酶促反應底物呈現的顏色對被測量的物質進行定性測定或定量測定的方法[55]。目前，ELISA是食品安全檢測被廣泛首選和考慮的免疫分析方法之一，具有成本相對較低、使用方便、可靠、快速等優點[56]。而QDs由于獨特的光學特性成為了最理想的熒光標記材料，其在熒光標記技術中占據了一個新的門類，因與ELISA結合具有高靈敏度和良好的可及性而得到了廣泛的應用[57]。Liang等[58]合成了CdTe QDs，并利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成H2O2和葡萄糖酸進而介導MPA QDs熒光猝滅作為免疫分析法的熒光信號輸出，開發了一種新的基于QDs熒光ELISA，實現了玉米提取物中赭曲霉毒素A的快速檢測，該方法的線性范圍為2.4 pg/mL～625 pg/mL，檢測限為2.2 pg/mL，該方法為其他霉菌毒素和生物分子的檢測提供了新思路。

3 展望

本文主要綜述了QDs標記免疫分析技術在食品安全檢測中的應用現狀，該方法作為一種具有良好發展前景的技術，在食品安全檢測領域中得到了較好的應用，表現出樣品前處理簡單、反應條件溫和、分析時間短、特異性強、靈敏度高等優點。然而要真正實現QDs在食品安全檢測中的應用，需要解決的問題還很多，如采用更加環境友好的方法制備QDs，解決與抗體或抗原偶聯后存在水溶性降低且熒光容易猝滅問題，以及開發新型的識別元件，并將其與QDs偶聯制備新型探針用于提高食品安全檢測方法的靈敏度和穩定性等。隨著QDs的制備工藝不斷完善，標記方法不斷改良，基于QDs標記的免疫分析技術在食品安全檢測領域中的應用會越來越廣泛。