植物多糖的提取、修飾及其糖代謝作用

賈朋賀，劉紅*，楊定國，趙偉杰

（1.海南師范大學化學與化工學院海口市熱帶特色藥食同源植物研究與開發重點實驗室，海南 海口 571158；2.海南科技職業大學海南省藥食同源資源重點實驗室，海南 海口 571126）

多糖是由糖苷鍵連接的長鏈單糖單元組成的高分子碳水化合物[1]。高等植物、動物、細菌以及微生物多糖具有廣泛的生物活性，如免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等。植物多糖能抑制葡萄糖的產生、促進肝糖原合成，故在預防糖代謝相關疾病（糖尿病、肥胖與營養不良）中顯得極其重要。糖尿病是由于胰島功能減退進而降低胰島素敏感性和糖原利用度，從而引起相關代謝酶活性、脂質代謝紊亂等問題。目前，多糖通過抗氧化、免疫調節、胰島素信號轉導、神經調節、腸道微生物群以及糖代謝物等途徑治療糖代謝疾病[2]。糖尿病及其并發癥是漸變氧化應激和抗氧化防御機制失衡，從而可能導致糖尿病人的細胞和組織損傷并且加速糖尿病并發癥的出現[3]，適當的抗氧化劑可以在一定程度上預防或延緩糖尿病并發癥的出現[4]。如牛膝多糖不僅能清除自由基，還能通過修復胰島β細胞，改善免疫系統來緩解高血糖的癥狀。麥冬多糖降低了由鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘發糖尿病模型小鼠的血糖濃度，增加胰島素的水平，改善胰島素水平。多糖通過信號轉導通路調節糖代謝，如黃芪多糖調節了糖尿病小鼠骨骼肌胰島素中的蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）/葡萄糖運載體 4（glucose transporter 4，GLUT4）信號通路[5]，PKB 在脂肪細胞表達從而刺激葡萄糖的攝取和GLUT4向細胞膜的靠近。多糖通過調節神經靶點海馬體，起到增強抗氧化性、改善記憶力、緩解高血壓的作用。天然多糖是由葡聚糖、果聚糖、木聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖組成的聚合物（如半乳甘露聚糖、果膠）構成，難消化、難發酵的桑椹多糖通過調節腸道微生物菌群，提高健康腸道微生物數量[6]和體系內糖酶[7]活力來調節糖代謝紊亂。鑒于研究者已經對黃芪、苦瓜、南瓜、麥冬、石斛、茶、桑葉等植物多糖的降糖活性及機制做了深入的研究，本文對國內外植物多糖的提取技術（溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法）和分離純化技術（離子色譜法、親和色譜法、凝膠柱層析法、膜分離技術）以及硫酸化、乙酰化、羥丙基、羧甲基化修飾多糖以及降糖活性進行綜述，為進一步研究多糖的降糖機制提供理論基礎。

1 提取技術

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是提取植物多糖的常用方法，主要溶劑為水和乙醇[8]。PAKROKH[9]利用水提法來提取藥蜀葵根多糖，具有生產過程安全、提取效率高等優點。為提取分子量大、分支度高的植物多糖，有時采用酸堿提取法。酸堿提取法是將植物浸泡在酸堿溶液中，酸堿能夠迅速破壞植物的細胞結構和改變細胞膜的通透性，縮短多糖的溶出時間，明顯提高多糖提取率[10]。Li等[11]利用酸堿提取法提取馬鈴薯皮中水不溶性膳食纖維，當酸堿提取時間為35 min、酸提取濃度為1.5%、堿提取濃度為1.6%時，水不溶性膳食纖維的提取率為12.6%。Guidara等[12]采用酸溶法，用pH 3.0的檸檬酸提取薄荷多糖，結果表明該多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有較強的抑制活性。Gu等[13]利用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液從番荔枝渣提取酸性多糖。Jiang等[14]利用堿溶法獲得裙帶菜硫酸多糖，提取率為（21.59±1.35）%。Vanavil B等[15]利用熱水浸提法和鹽酸提取法從褐藻中提取硫酸化多糖，鹽酸提取法得率為1.2%，熱水浸提法得率為3.6%，大于鹽酸提取法多糖得率。謝丹丹等[16]發現黃芪堿溶多糖最優提取工藝條件為提取溫度70℃、提取時間 130 min、料液比 1∶20（g/mL），此條件下提取率為（15.63±0.36）%。由此可見，堿溶和水提法有利于溶解蛋白質，所得多糖提取率較高。

1.2 新興提取技術

1.2.1 生物酶提取法

多糖內嵌蛋白質形成細胞外基質，生物酶可水解植物細胞壁釋放多糖和蛋白質，提高多糖提取速率。許多研究者利用酶法提取提高多糖產量，如糖酶（粘酶、纖維素酶等）和蛋白酶（堿性蛋白酶，中性蛋白酶等）均取得了較好的試驗結果。Zhu等[17]利用復合酶于50℃條件下提取粗綠茶多糖30 min，提取率比熱水浸提法高4.52%。Jiang等[18]利用纖維素酶提取綠豆皮多糖，在55℃條件下提取綠豆皮粉末3 h，提取率為1.61%。Li等[19]利用酶提取法提取沙蒿多糖，確定了多糖含有抗糖尿病成分。Li等[20]利用酶提法提取菊三七多糖，發現纖維素酶量為150 mg/g時提取率最高。

1.2.2 超聲波輔助提取法

超聲輔助提取法是利用超聲波空化使植物的細胞壁以及植物整個身體加速破裂，讓細胞內的有效物質能夠更快地釋放到溶劑內，大幅度提高多糖的提取效率。超聲波空化作用于介質時，介質與超聲波之間會產生十分巨大的瞬間壓力。Yang等[21]利用高壓超聲輔助提取枳椇多糖，在超聲功率330 W、提取溫度68℃、提取時間22 min條件下，得到提取率最高為（11.81±0.26）%，并且發現枳椇多糖具有明顯的降血糖作用。Guo等[22]利用超聲波輔助法提取酸漿花萼多糖，在90℃下以200 W的功率提取多糖35 min，發現多糖能夠保護和逆轉糖尿病小鼠中由于四氧嘧啶破壞引起的β細胞壞死，具有顯著的抗糖尿病活性。Jia等[23]利用超聲波輔助酶法提取羊棲菜多糖，用2 000 mL酶溶液（1%果膠酶和1%纖維素酶，調節酸堿度至4.5）在50℃下處理1 h，然后在400 W的超聲波功率下進行30 min，隨后在90℃下提取2 h，提取率為（18.43±1.04）%。逆轉錄-定量聚合酶鏈反應分析表明，羊棲菜多糖的抗糖尿病作用可能與加速肝臟和肌肉對血糖的吸收和利用以及抑制肝臟葡萄糖的產生密切相關。Chen等[24]采用超聲波輔助提取法從薏米中提取多糖，在超聲功率10 kW、回流溫度95℃、回流時間4 h的條件下，得到水溶性多糖，該多糖可以起到調節血糖的作用。Jia等[25]利用超聲波輔助法提取玉米須多糖，將玉米須殘渣與去離子水混合，使用超聲波裝置于100℃提取3次，持續1 h，發現超聲波輔助提取法提取的玉米須多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性最高。

1.2.3 微波輔助提取法

微波是波長為1mm～1000mm電磁波，頻率0.3GHz～300 GHz。微波加熱是通過被加熱體內部偶極分子高頻往復運動，產生“內摩擦熱”而使被加熱物料溫度升高，不須任何熱傳導過程，就能使物料內外部同時加熱、同時升溫，加熱速度快且均勻。當植物細胞吸收過多的能量，細胞內部的能量與壓力成正比，內部能量越高即細胞內部壓力也越大，內部壓力超過細胞壁承受的極限時細胞就會破裂，使細胞以及細胞內的物質溶解入溶液之中。研究者們發現微波作為使細胞內增加能量的媒介，微波射線穿過溶劑并穿透細胞時，細胞液以及溶劑都會吸收微波射線中的能量，進而達到加速提取的目的。張萍等[26]研究表明黃芪多糖微波輔助提取的提取率比傳統提取法高。Chen等[27]采用微波輔助提取辣木多糖，提取條件為時間70 min，微波功率700 W、溫度 70℃、液固比 35∶1（mL/g）時，分離出對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的組分。MA等[28]利用微波輔助復合酶提取甜玉米多糖，發現甜玉米多糖可顯著增加大鼠體重，并以劑量依賴的方式降低血糖水平。Cao等[29]采用微波輔助法提取蒼白馬尾藻多糖，發現最佳提取條件為21.0%乙醇和22.0%硫酸銨、料液比 1∶60（g/mL）、提取時間 15 min、微波功率830 W、提取溫度95℃，該多糖具有很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。張艷軍等[30]運用微波輔助提取黃秋葵多糖，在緩凍時間 16 h，液料比 40 ∶1（mL/g）、浸提時間2.2 h、浸提溫度65℃、微波功率310 W條件下，提取率為17.17%。結果表明黃秋葵多糖能抑制α-葡萄糖苷酶，具有明顯的降血糖作用。Ren等[31]利用微波輔助提取鼠尾藻多糖，在提取時間23 min，微波功率547 W，提取溫度80℃，料水比1∶27（g/mL）條件下，提取率為（2.84±0.09）%。結果表明鼠尾藻多糖具有很強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并能提高胰島素抵抗的HepG2細胞對葡萄糖的攝取。

2 分離純化技術

2.1 色譜法

2.1.1 離子色譜法

離子交換色譜法是利用分子電荷具有極性或離子的性質，通常用陰離子（含-COOH）樹脂分離中性和酸性多糖。由于高糖醛酸多糖與離子交換樹脂之間存在強作用力，故可利用不同離子強度溶液洗脫制備中性和酸性多糖。陰離子交換劑包括二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-52和DEAE-Sepharose等。如使用純水和不同濃度的NaCl溶液作為流動相，利用DEAE-52或DEAESepharose柱對玉米、桑黃等粗多糖進行分離純化。

2.1.2 親和色譜法

親和色譜屬于選擇性液體吸附色譜法，適合植物多糖的小規模純化分離。然而很難找到特定多糖的適當配體。金屬離子螯合樹脂去除多糖和蛋白質的原理是金屬離子固定化親和色譜法。樹脂為載體吸附Zn2+，固定后的Zn2+與氨基酸形成絡合物殘基（如組氨酸的咪唑基團）在蛋白質表面實現蛋白質的分離。金屬離子螯合樹脂方法的最佳吸附參數為香蒲粗多糖1.5 mg/mL、吸附時間30 min、初始pH 7.0、吸附溫度為30℃，、流量為1.5 BV/h、樹脂柱的徑高比為1∶15。該方法具有更高的脫蛋白率、脫色率、回收率和綜合吸附效果[32]。王海林等[33]利用Cu2+進行螯合的親和層析法分離純化油茶籽多糖，吸附量為25.27 μg。DOGRA B等[34]利用10 mmol/L硫酸銅溶液預固定的固定化金屬親和柱色譜法（immobilized metal ion affinity chromatograph，IMAC）去除光合海洋微藻四倍體水溶性多糖中蛋白質和脂質的雜質。HAHN T等[35]利用染料親和層析法從巖藻聚糖中分離多糖，在pH 1和pH 6時，多糖純度分別提高了1.55倍和1.69倍，平均產量為5 g/100 g。此外在pH值為6時，純化的巖藻聚糖在分子量和硫含量方面超過市售巖藻聚糖（≥95%純度）的質量。路垚[36]利用RCA-Sepharose 2B親和層析法分離純化金花茶多糖，RCA-Sepharose 2B與金花茶多糖的親和率為21.4%。

2.1.3 凝膠柱層析法

凝膠色譜法的原理是根據凝膠孔徑的大小分離不同組分。用凝膠柱層析法分離多糖是以分子篩為基礎，與多糖的大小和形狀有關。凝膠填料的選擇取決于多糖的分子量分布。常用的凝膠主要包括葡聚糖凝膠、瓊脂糖、生物凝膠、聚丙烯酰胺葡聚糖、復合凝膠、凝膠介質等。流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。Guo等[37]利用凝膠柱層析法從山楂果實中分離純化出富含葡萄糖的雜多糖HAW1-2。Gu等[38]利用凝膠柱層析法從黃精中分離純化出黃精多糖。Fan等[39]利用葡聚糖凝膠層析純化藜麥粗多糖中可溶性非淀粉多糖組分。

2.2 膜分離技術

膜分離法是利用膜的選擇透過性，對膜施加一定的壓力使原料中的有效成分穿過膜。超濾技術是根據不同組分的分子大小而設計不同孔徑膜，在壓力作用下，使原料中的小分子物質通過膜一側，同時將大分子物質隔離在膜的另外一側，以此來分離不同的組分。宮春宇等[40]利用超濾法制備玉米須多糖，確立超濾的工藝參數。

3 多糖修飾

將其他功能基團接入多糖分子進行接技修飾，以此來增加功能基團。經過修飾后的多糖分子的結構活性會有顯著提高。常用的多糖結構修飾法有硫酸化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硒化修飾法。

3.1 硫酸化多糖

硫酸化修飾法的基礎原理是將硫酸基團接入多糖的糖基，利用二甲基甲酰胺、三氧化二硫、吡啶得到硫酸多糖。枸杞多糖和乙胺-三氧化二硫、二甲基甲酰胺于50℃攪拌12 h制備硫酸枸杞多糖[41]。氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺在85℃條件下反應3 h可制備硫酸裙帶菜多糖。利用三氧化二硫吡啶制備的鼠尾藻硫酸多糖表現出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性和對胰島素抵抗（insulin resistance，IR）-肝癌細胞葡萄糖消耗的促進作用。以微波輔助提取法得到褐海帶裙帶菜硫酸多糖的組分具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，提高胰島素抵抗的HepG2細胞對葡萄糖的攝取。組織病理學觀察及肝糖原測定結果表明可減輕胰島細胞損傷，減輕肝臟脂肪變性，促進胰島細胞凋亡以及肝糖原的合成[42]。

3.2 乙酰化多糖

乙酰化修飾法的基本原理是將乙酰基接入多糖支鏈中，使多糖支鏈出現伸展作用，進而發生一定的變化，最終多糖的烴基移動暴露在最外側。例如馬齒莧多糖乙酰化條件為馬齒莧多糖0.5 g，加入15 mL蒸餾水充分溶解，用NaOH（40 mg/mL）調節pH 9.0。邊攪拌邊滴加乙酸酐，30℃反應4 h后，濃鹽酸調節pH 7.0。離心后取上清液透析48 h，濃縮、冷凍干燥后得到乙酰化馬齒莧多糖。李銀莉等[43]發現馬齒莧多糖經過乙酰化修飾后抗氧化活性提高。Zhao等[44]將青錢柳多糖（cyclocarya paliurus polysaccharide，CPP）0.2 g溶解在10 mL蒸餾水中，緩慢加入0.8 mL乙酸酐，并加入5 mL氫氧化鈉，將酸堿度控制在8.0～8.5，反應混合物在40℃下保持2 h，然后加入10 mL鹽酸終止反應（溶液酸堿度為7），發現乙酰化青錢柳多糖有較好的抗氧化能力。MATOSO等[45]將胖大海（0.5 g）懸浮在50℃的20 mL甲酰胺中，劇烈攪拌1 h。加入吡啶（1.5 mL）和乙酸酐，溶液在磁力攪拌（100 r/min）下保持24 h，制得乙酰化多糖。

3.3 羧甲基化多糖

羧甲基化多糖是指多糖大分子鏈中單糖分子上的某一個或幾個羥基被羧甲基基團取代而形成的一類化學結構復雜、生物活性多樣、構效鮮明的陰離子多糖衍生物。白家峰等[46]表明羧甲基化修飾能夠改變羅漢果多糖的生物活性，提高羅漢果多糖的抗氧化性能。Zheng等[47]研究表明羧甲基化對棕櫚仁膨化膳食纖維α-淀粉酶活性抑制率變強。Cheng等[48]以氯乙酸為原料制備羧甲基化-硫酸化大蒜多糖。

3.4 羥丙基化多糖

羥丙基化多糖是使多糖在堿性溶液中形成醇鈉，再與環丙烷制備羥丙基多糖。Chen等[49]將多糖或膳食纖維或水解淀粉漿5 g～10 g加入10 mL5%～6%NaOH溶液，在35℃下攪拌堿化30 min，再加入2 mL的環丙烷，控制反應溫度為40℃～60℃和時間4 h～24 h。反應結束后，用乙酸將反應產物調節至中性，經過濾后將沉淀于60℃真空干燥，粉碎，制得羥基化多糖。Nagata等[50]研究表明，喂食羥丙基-正常玉米淀粉組或羥丙基-糯玉米淀粉組的大鼠盲腸微生物組成發生改變，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度升高；短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）含量增高，盲腸 pH 值和腸系膜脂肪細胞面積降低，血漿胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）水平和盲腸黏蛋白含量升高。因此，羥丙基-玉米淀粉具有促進腸道發酵和脂質代謝的有益生理特性。

3.5 硒化多糖

硒化修飾是指硒元素與多糖中單糖上2個順式相鄰羥基形成五元環的亞硒酸酯[51]。目前，主要的硒多糖有硒化卡拉膠、SeOCl2試劑合成的黃芪多糖、亞硒酸和甘草多糖合成的甘草硒多糖等。通過硒化修飾可將多糖與硒元素有機結合成硒多糖，是一種增強多糖生物活性的有效方法。如桔梗硒多糖對α-糖苷酶抑制作用強于桔梗多糖。

4 結語

目前植物多糖的提取方法主要為溶劑提取法、生物酶提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法，植物多糖的分離純化方法主要為離子色譜法、親和色譜法、凝膠柱層析法、膜分離技術，植物多糖修飾方法主要為硫酸化修飾、乙酰化修飾法、羥丙基修飾、羧甲基化修飾。近年來植物多糖的高效提取、分離純化以及化學修飾被研究得越來越深入，化學修飾植物多糖在降糖活性上的價值越來越高。相信隨著對植物多糖話化學修飾研究的進一步深入，化學修飾植物多糖的結構及其降糖活性機制可以進一步闡明。