一測多評法測定首薈通便膠囊中4種大黃素類成份含量

馬云，韓振明，馬健，張微，關永霞，張貴民

1魯南厚普制藥有限公司，臨沂 276006；2中藥制藥共性技術國家重點實驗室，臨沂 276006；3魯南制藥集團股份有限公司，臨沂 276006

首薈通便膠囊由何首烏、蘆薈、決明子、枸杞子、阿膠、人參、白術、枳實共8味中藥組成，可養陰益氣、瀉濁通便，臨床上主要用于治療功能性便秘及中醫辨證屬氣陰兩虛兼毒邪內蘊證者，可全面改善胃腸功能，適合老年人和體質虛弱者服用[1-2]。現代研究表明，首薈通便膠囊中的8種藥材均具有抗炎、抗氧化、免疫調節等多重藥理活性[3-5]。其中，何首烏目前已知分離出100多種成份，如大黃酚、大黃素等。大黃酚能有效促進腸道運動，防止便秘；蘆薈中所含蘆薈苷、蘆薈大黃素等活性成份具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保護肝臟和神經等藥理活性；決明子中含有大黃素、大黃酸、大黃酚、橙黃決明素、決明子苷等，具有降血脂的生物活性；枸杞子主要含枸杞多糖、甜菜堿、枸杞色素，枸杞多糖是一種水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成份，能促進免疫、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基、抗疲勞、抗輻射、保肝；阿膠富含豐富的蛋白質，如賴氨酸、蘇氨酸、明膠、精氨酸、組氨酸以及微量元素，在抗腫瘤、促進骨愈合以及促進造血功能等方面均有明顯效果；人參主要活性成份有人參皂苷和多糖，對中樞神經系統、循環系統、內分泌系統等均有調節作用；白術主要化學成份有揮發油、多糖、內酯類等，如白術內酯、白術多糖、苷類、氨基酸等，具有抗腫瘤、抗炎、調節消化系統等藥理作用；枳實中同樣已分離出多種化學成份，如黃酮苷類、生物堿、揮發油等，具有調節消化系統、保護胃腸道、降脂、保護心血管、抗癌、免疫調節的藥理作用。8味中藥的多種活性成份可在臨床治療中達到協同作用[6-7]。

首薈通便膠囊的現行檢測標準主要以薄層色譜法鑒別制劑中人參、枳實、蘆薈、阿膠4種藥材，同時采用HPLC法測定制劑中何首烏的2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、枳實的柚皮苷含量。多指標多成份同時測定已成為綜合評價中藥處方制劑質量的主要研究方向，但活性成份標準對照品的消耗一定程度上限制了其發展。一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）可以某一種對照品為內標參照物，實現多種成份同步測定，目前已應用于多種中藥材、中藥制劑的品質評價[8-9]。基于此，本研究擬建立以大黃酚為內標參照物的QAMS，并對首薈通便膠囊中活性成份的含量進行測定，以優化首薈通便膠囊處方制劑的質量檢測方法，達到降本增效的目的。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（包括DAD檢測器、四元低壓梯度泵、AgilentOpen Lab色譜工作站，安捷倫科技有限公司）；Waters高效液相色譜儀（包括e2695四元泵、2998二極管陣列檢測器、自動進樣器，美國Waters公司）；LE204E電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；01193-YP601N電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆薈苷A（aloin A，批號：110787，純度≥98%）、蘆薈苷B（aloin B，批號：110788，純度≥98%）、蘆薈大黃素（aloe emodin，批號：110775，純度≥97%）、大黃酚（chrysophanol，批號：110796，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇（色譜純）、磷酸（色譜純）均購自南京化學試劑股份有限公司；甲醇（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；有機濾頭（孔徑0.22μm，愛西默科技有限公司）；純水。實驗用14批首薈通便膠囊樣品由魯南厚普制藥有限公司提供，樣品信息見表1。

表1 首薈通便膠囊樣品信息表

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2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備

取首薈通便膠囊內容物適量，研細，取樣品粉末0.5g，精密稱定，置于50ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50ml，密塞，稱重，超聲處理（功率250W，頻率100Hz）60min，放冷至室溫，再次稱重，用50%甲醇溶液補足減失重量，搖勻，靜置，吸取上清液，0.22μm濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚對照品各適量，用50%甲醇溶解并制成濃度分別為0.8010、2.9365、0.1760、0.0880mg/ml的對照品儲備溶液，備用。取上述對照品儲備液適量，以50%甲醇稀釋，制成每1ml含蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚分別為0.0801、0.5873、0.0176、0.0088mg/ml的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫（見表2）；柱溫為30℃；流速為1.0ml/min；進樣量為5μl；檢測波長為220nm。理論板數按大黃酚計算不得低于5000。色譜圖見圖1。

表2 洗脫梯度

圖1 對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖

2.3 線性關系

分別取上述混合對照品溶液不同體積，按照“2.2”項下色譜條件測定，以進樣濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。結果表明蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚4種成份在各自范圍內線性關系良好。見表3。

表3 4種活性成份線性關系

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定峰面積，重復進樣6次，記錄峰面積并分析。結果蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚的平均峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取樣品（批號：200101）粉末6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，以“2.2”項下的色譜條件測定峰面積，結果見表4。各組份RSD均小于2.5%，表明該方法重復性良好。

表4 4種活性成份重復性試驗含量測定結果

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2.6 穩定性試驗

取樣品（批號：200101）0.5g，精密稱定，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48h進樣，測得蘆薈苷A、蘆薈苷B、蘆薈大黃素、大黃酚峰面積的RSD均小于2.0%，表明樣品溶液在48h內穩定性良好，詳見表5。

表5 4種活性成份穩定性試驗峰面積測定結果

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2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品粉末6份，分別準確加入含有等量各組份對照品的對照品儲備液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣測定，結果各組份回收率的RSD均小于4.0%，詳見表6。

表6 4種活性成份加樣回收率試驗

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2.8 相對校正因子與相對保留值的確定

2.8.1 相對校正因子（fk/s）的計算

采用多點校正法，以多個質量濃度點計算所得平均值為fk/s。校正因子計算公式為fk/s=（As×Ck）/（Ak×Cs）（公式1）；待測成份質量濃度計算公式為Ck’=（fk/s×Cs×Ak’）/As（公式 2）。式中As為內標參照物色譜峰峰面積，Cs為內標參照物的質量濃度，Ak為待測組份色譜峰峰面積，Ck為待測組份的質量濃度。詳見表7。

表7 多點校正法計算各成份相對校正因子

2.8.2 相對保留值的計算

以大黃酚色譜峰的保留時間為參照，計算各待測組份的相對保留值（relative reserved time，RRT），計算公式為RRT=Tk/Ts（公式3），式中Ts為內標參照物保留時間，Tk為待測組份保留時間，結果見表8。

表8 多點校正法計算各成份相對保留值

2.8.3 耐用性評價

本實驗考察了不同色譜系統、色譜柱、試驗時間、操作人員對fk/s與RRT的影響，結果見表9和表10。由表可知，不同考察條件下各活性成份fk/s的RSD均小于3.0%，相對保留值的RSD均小于5.0%，表明在試驗所考察的各因素范圍內均可準確測定各成份的含量。

表9 相對校正因子的耐用性試驗

表10 相對保留值的耐用性試驗

2.9 樣品含量測定

2.9.1 QAMS與外標法（external standard method，ESM）測定含量的結果比較

取14批首薈通便膠囊內容物供試樣品，按“2.1.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，分別通過QAMS、ESM進行含量計算，并對結果進行比較，詳見表11。結果表明，不同計算方法得到4種活性成份含量的RSD均小于3%。

表11 樣品含量測定結果 mg/g

2.9.2 多點校正理論保留時間與ESM法實際保留時間比較

將14批首薈通便膠囊供試品通過多點校正因子計算的理論保留時間與ESM的實際保留時間進行比較，結果無顯著差異，見表12。

表12 4種成份的理論保留時間與實際保留時間比較 min

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3 討論

本實驗分別考察了提取溶劑（70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇）、稱樣量（0.25、0.50、1.00g）、溶劑體積（25、50、100ml）以及超聲處理時間（30、60、90min）對樣品含量的影響。結果表明，當提取方法為稱樣量0.50g、溶劑體積50ml、50%甲醇提取、超聲處理60min時，樣品色譜圖峰面積適中，因此確定該條件作為本實驗的樣品提取方法。

本實驗測定了首薈通便膠囊中4種活性成份的含量，其中蘆薈苷A與蘆薈苷B是同分異構體，可相互轉化，且一定條件下均可氧化分解生成蘆薈大黃素以及其他成份，在現有檢測方法中，蘆薈苷A與蘆薈苷B均以蘆薈苷計，且實際檢測中常存在分離度低的情況，影響色譜峰峰面積的準確計算[10]。基于此，本實驗考察了流動相中有機相的比例、pH及洗脫梯度等，最終以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時蘆薈苷A與蘆薈苷B的分離度最好。

本研究基于HPLC建立了以大黃酚為內標參照物的QAMS定量分析方法，可用于首薈通便膠囊的質量評價。以大黃酚為對照，首薈通便膠囊內容物中3種活性成份的相對fk/s分別為3.65、4.29、0.77，RRT分別為0.83、0.86、0.97。14批供試品中，ESM與QAMS的含量計算結果無統計學差異，表明QAMS測定結果可靠。本研究所建立的QAMS具有穩定、準確、簡單、快捷、成本低等特點，可較全面地反映首薈通便膠囊的內在質量，且檢測成本和檢測時間均大幅降低。該方法可用于首薈通便膠囊的質量評價，也為其他中藥處方制劑的質量控制提供了一定參考，有利于提高中藥處方制劑的質量控制水平。