FAAS與ICP-MS測定嬰配奶粉中銅、鋅的等效性研究

詹勝群，葛城，周鈞，周榮杰，劉金梅，顏復張*

澳優乳業（中國）有限公司（長沙 410200）

嬰幼兒配方奶粉是非母乳喂養嬰幼兒營養的重要來源，銅、鋅元素是人體必需的14種微量元素中的2種[1]。銅參與人體的造血、血紅蛋白合成等過程，鋅參與機體免疫功能、影響維生素C的代謝等，二者與嬰幼兒的生長發育、第二性征發育及智力發育等相關[2-5]。銅、鋅還是構成金屬酶的必需成分，如含鋅的碳酸酐酶、含銅的酪氨酸酶、含二者的超氧化物歧化酶等[6-9]。故準確測定嬰配奶粉中銅鋅含量與奶粉品質和嬰幼兒健康至關重要。

對于奶粉中銅、鋅的檢測，GB 5009.13—2017《食品安全國家標準 食品中銅的測定》中第二法和GB 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中銅的測定》中第一法給出的FAAS法及GB 5009.268—2016中第一法給出的ICP-MS法是我國常用的強制標準方法[10-12]，由于FAAS法常與干法消解聯用，且具有儀器成本低、稱樣量較多、線性范圍廣等特點，故被國內不少乳企、檢測機構采用。而在ISO 21424—2018中，檢測方法是微波消解-ICP-MS法[13-14]，ISO方法是國際標準化組織指導和協調全球檢測推薦的標準方法[15-16]，除方法原理與FAAS法有本質區別外，該方法要求奶粉樣品復溶，且消解過程添加甲醇、過氧化氫等，樣品處理方式差異大。對于有奶粉進出口業務的乳企而言，這種方法間的差異可能導致同一樣品的測定結果不一致，從而導致抽檢結果無法滿足雙邊監管要求，故研究這2種方法的差異對雙邊檢測結果相互合規合法具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和標準品

電感耦合等離子體質譜儀（Thermo Scientific? iCAP Q，賽默飛）；原子吸收光譜儀（配火焰原子化器，附銅、鋅的空心陰極燈，AA240FS，美國瓦里安）；超純水制備裝置（Milli-Q，美國密理博）；電子天平（ME204E，梅特勒托利多）；微波消解儀（ETHOS UP，北京萊伯泰科）；箱式電阻箱（MFLC16/12A，天津市泰斯特）；磁力攪拌器（90-2型，上海滬西儀器）。

甲醇（MS級，上海安譜）；硝酸（MS級，上海安譜）；30%過氧化氫（GR，天津市科密歐）；內部質控樣（S18，三段，牛奶粉），市售；外部質控樣（QC-IP-701，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心）；奶粉樣品（S1～S17，市售嬰幼兒配方奶粉）；多元素標準溶液（Cu 2.5 mg/L、Zn 10 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；鍺、碲、銅、鋅標準溶液（1 000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 試驗方法

1.2.1 比對方案設計

方法比對分為4個部分，見表1。檢測過程中2名試驗操作者均為實驗室有經驗的授權人員，每名試驗員在相互獨立的情況下分別采用GB標準和ISO標準進行樣品測試。外部質控樣測試得到的數據組成成組資料，樣品測試得到的數據組成成對資料。

表1 比對方案

1.2.2 試驗樣品信息

序號1～17的樣品為市售的不同段數（1、2和3段）、不同產地（國產、進口）、不同基質（牛奶、羊奶）的嬰幼兒配方奶粉；序號18～19為質控樣。樣品信息見表2。

表2 樣品基本信息

1.3 數據處理

1.3.1 消解條件

微波消解條件：室溫至120 ℃（1 800 W），升溫8 min，恒溫10 min；120 ℃至160 ℃（1 800 W），升溫8 min，恒溫10 min；160 ℃至180 ℃（1 800 W），升溫5 min，恒溫20 min。干灰化條件：固體試樣約2.5 g于坩堝中，1 000 W電爐加熱炭化至無煙，轉移至箱式電阻箱中，于550 ℃灰化5 h。

1.3.2 儀器分析條件

ICP-MS條件：等離子功率：1 550 W；冷卻氣流：14 L/min；輔助氣流量：0.8 L/min；霧化氣流量：1.074 L/min；采樣深度：5 mm；重復次數：3次；采集模式采用跳峰；霧化室溫度2.7 ℃；氦氣流量4.3 mL/min。FAAS條件：波長213.9 nm，狹縫0.2 nm，空氣13.50 L/min，乙炔2.00 L/min，測量時間5 s，重復次數3，測量模式采用積分。

1.3.3 數據處理

FAAS信號的采集及定性、定量分析采用Spectr AA（Version：5.1 PRO）軟件，ICP-MS信號的采集及定性、定量分析采用Qtegra（Version：2.7 SR1）軟件，試驗數據的圖形繪制和表格制作采用Excel 2019軟件和WPS Office 2021軟件。

2 結果與分析

2.1 方法文本比較

2個方法的原理及關鍵步驟差異見表3。ICP-MS法則采用大樣本復溶的方式提高取樣的均一性和代表性，理論上ISO方法檢測的結果應具有更好的精密度。定量方式上，FAAS法采用外標法，而ICP-MS法采用內標法，且內標加標方式為前處理加標。檢出限和定量限上，ICP-MS限值設定得更低。整體上看，2種方法差異較大。

表3 方法文本比較

2.2 方法性能參數比較

重復性試驗是評價隨機誤差大小的方法，由表4可知，對于儀器精密度，FAAS法和ICP-MS法差異并不大，均＜1%，但對于方法精密度，FAAS法相對標準偏差（SRSD）2個指標均大于ICP-MS法，可見ICPMS法方法精密度更好，但2種方法的精密度均符合ISO標準要求（＜5%）和國標要求（＜7.5%），試驗的隨機誤差的控制都在要求范圍內。FAAS法和ICPMS法回收率在90%～110%之間，回收率均符合GB/T 27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》要求。定量限結果均小于標準規定值。

表4 方法性能參數

2.3 質控樣檢測比對

由表5可知，檢測結果均在標準物質參考值不確定度范圍內且均和特性值接近，表明2種方法正確性良好，無大的系統誤差影響試驗。由表6統計分析結果知兩組數據方差具有同質性，可對樣本數據進行均數差數t檢驗和F檢驗（方差分析）。t檢驗表明2種方法間銅、鋅差異都極顯著，銅鋅ISO方法檢測結果高于GB方法檢測結果。銅平均數差數置信區間為4.24～35.89 μg/100 g，置信度為99%；鋅平均數差數置信區間為0.024 1～0.269 mg/100 g，置信度為99%。方差分析見表7，可知同樣具有差異極顯著的結論。

表5 外部質控樣QC-IP-701結果比對

表6 內部質控樣檢測結果的統計分析

表7 內部質控樣測結果的方差分析

由于差異顯著性檢驗的性質，其結論只表示所檢驗的兩處理樣本來自同一總體的可能性小于或大于統計上公認的概率水平α（0.05或0.01），并沒有提供兩處理間的差異有多大的信息，故要對差異進行定量分析還需要結合預先設定等效標準的雙向單側t檢驗（TOST）來完成方法間的等效性評價[17-20]。預先設定2個等效標準（Δ為5%和10%）檢驗方法的等效性，由表8可知，銅、鋅在等效標準5%內方法均不等效，在10%內方法均等效。

表8 不同等效標準下的TOST檢驗結果

2.4 樣品檢測比對

樣品的檢測結果及結果差值見表9。由圖1和圖2可看出：銅所有的點均在95%一致性界限以內，界限內差值的絕對值最大為36.49 μg/kg（圖中白色點）；鋅有94.1%（16/17）的點在95%一致性界限以內，差值的絕對值最大為0.247 2 mg/kg（圖中白色點）。若銅、鋅分別以所有測定結果的算數均值的±10%（-39.77，+39.77）μg/kg、（-0.039 13，+0.039 13）μg/kg作為應用可接受的界限，這種相差幅度在應用上均可接受，因此可以認為2種方法測量的結果具有較好的一致性，并且可以互相代替使用[21-26]，且該界限與國標方法中關于銅、鋅精密度的規定“在重復性條件下獲得的2次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%”相符合。但銅、鋅分別以所有測定結果的均值的±5%為應用可接受界限時，則2種方法相差幅度在應用上均不可接受。配對t檢驗結果見表10，可知銅差異極顯著、鋅差異顯著，且銅、鋅ISO方法檢測結果均高于GB方法檢測結果。可見對于2種方法間系統誤差的判定，樣品與質控樣的檢測比對結果基本一致。

圖1 銅Bland-Altman圖

圖2 鋅Bland-Altman圖

表9 樣品檢測結果

接表9

表10 配對t檢驗結果

以國標標準FAAS法為參考方法，以ISO標準ICPMS法為候選方法。銅、鋅測試結果的回歸分析分別見圖3和圖4。線1為以參考方法測定結果為X值、以候選方法為Y值所擬合的回歸曲線，線2代表候選方法值=參考方法值，方程為y=x；線3和線4代表回歸曲線95%的置信區間估計。對于銅，線1在線2上，線2未完全落在95%置信區間范圍內，表明代表實際測試結果的回歸曲線在所分析濃度范圍內與標志著2種方法結果一致的參考曲線Y=X在統計學上不一致，即隨著X值減小，線2與線1的偏差逐步增大，當X小于400時，線2已不能落在置信區間內，提示隨著樣品中銅含量降低，2種方法的測定結果差異逐步增大。對于鋅，回歸曲線與參考曲線有同樣的趨勢，提示隨著樣品中鋅含量降低，2種方法的測定結果差異逐步增大，但鋅的線2在分析濃度范圍內與線4基本貼合，差異幅度變化很小。數據分析結果見表11。銅、鋅回歸系數與0都差異極顯著，這代表2種方法的測定結果的線性關系很密切。此外，銅、鋅回歸系數與1之間假設檢驗均不顯著、截距與0之間假設檢驗均不顯著，說明對方法間差異的判定受樣品濃度差異和基質差異而帶來的干擾較小，即恒定系統誤差和比例系統誤差較小[27]，但這2種誤差嚴格意義上不能歸類于系統誤差，因為回歸方程的回歸系數和截距對系統誤差不敏感。

表11 回歸系數、截距的t檢驗

圖3 銅元素的線性回歸方程

圖4 鋅元素的線性回歸方程

2.5 討論

TOST的等效標準的設定與Bland-Altman法一致性分析的應用依據需要方法使用者與業界各個相關方共同探討，同時結合考慮法規層面的需求[28-29]。顯著性檢驗在否定無效假設時受檢測方法精密度的影響而易犯一類錯誤，在接受無效假設時受樣本量不足、方差過大的影響而易犯二類錯誤，而TOST的無效假設和備擇假設與經典顯著性假設的位置相反，顯著水平為一尾概率，能夠降低統計中犯一類錯誤的概率。故檢測結果的評價應結合評價目的采用不同的統計手段進行處理。

“質控樣檢測比對”是在特定的檢測條件下判斷兩檢測方法間是否存在差異并界定等效的邊界，但是未能對不同測試對象、不同檢測濃度等條件存在情形下的方法間差異進行分析判定，而“樣品檢測比對”能綜合考慮樣品基質這種情況對分析結果的影響，能排除因配方奶粉類型的不同而帶來的誤差干擾，使分析結果更全面可靠。

3 結論

國標FAAS法與ISO標準ICP-MS法在分析原理、方法定量方式和樣品處理方式及其他細節參數上存在較大差異。根據方法比對結果，2種方法外部質控樣檢測結果均和真值接近，方法準確性均良好，精密度上ICP-MS方法相對更好，在10%等效標準范圍和應用依據上方法均具有等效性和較好的一致性，方法可互相替代使用，但在5%等效標準范圍和應用依據上方法均不具有等效性和一致性。對于有奶粉進出口業務的乳企而言，常規情況下這種差異應是可接受的，但當國內外質檢結果有一定差異又臨近標簽值限值的極端情況下時，這種差異也可能會導致雙邊檢測結果無法相互合規合法，故進出口乳企在面對這種差異時應引起重視。此外，ISO標準在奶粉樣品的前處理上采用復溶方式進行樣品制備，保障樣品的均一性使檢測結果具有更好的代表性，這也值得參考和借鑒。