抗生素對硝化污泥系統的影響及其去除特性

劉夢夢，郭 寧,*，劉雨昊，朱兆亮

(1.山東建筑大學市政與環境工程學院，山東濟南 250101；2.中建八局第一建設有限公司，山東濟南 250101)

抗生素作為一種常用的藥物活性物質被廣泛用于人類及動植物的疾病預防和治療中。研究[1]表明，30%～90%的抗生素通過人或動物排泄物的形式釋放到環境中。抗生素的長期存在及不斷積累，會給生態系統及人類健康帶來嚴重的潛在威脅。而傳統的活性污泥工藝對抗生素的去除效果并不佳[2-3]。

近期的研究[4-5]表明硝化污泥系統可以有效地促進多種抗生素的去除。例如，Batt等[6]通過研究發現甲氧芐啶在硝化活性污泥中去除率可高達50%，而在傳統活性污泥中去除率僅為1%左右。另外，抗生素的存在不可避免地會對微生物施加選擇性壓力，導致微生物群落變化，進而影響反應器的性能。例如，Li等[7]通過考察發現，序批式反應器中不同濃度的諾氟沙星對CODCr和氨氮存在不同程度的抑制作用，并且不同濃度的諾氟沙星對微生物的多樣性和豐富度均有影響。Deng等[8]在研究序批式反應器中的抗生素鏈霉素[(3 955±1 910)μg/L]對微生物群落結構影響時總結，污水處理系統可以通過調節細菌、古細菌和真核生物的組成以應對高濃度抗生素的壓力，從而維持反應器的正常運行。因此，探究抗生素選擇壓力下系統運行性能和微生物群落結構的變化，對提高污水處理工藝的穩定性和整體性能具有重要的理論和實際意義。目前，抗生素對硝化污泥系統運行性能和微生物群落結構的影響仍不明確。

本研究選取廣泛應用的磺胺甲惡唑(SMX)為研究對象，考察硝化污泥系統對抗生素的去除效果，分析抗生素對硝化污泥系統運行性能的影響，并重點探討不同濃度抗生素對微生物量及微生物群落結構分布的影響，以期為提高污水處理系統的運行性能及抗生素的有效去除提供合理的理論依據。

1 材料與方法

1.1 污泥來源及主要試劑

原始污泥取自濟南光大水務公司二沉池的回流污泥。SMX(CAS:723-46-6，C10H11N3O3S)標準品購于上海麥克林公司，甲醇、乙酸均為高效液相色譜級，其他普通化學試劑等均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 污泥馴化

本試驗采用好氧曝氣，逐步提高氨氮負荷的方式進行污泥馴化。馴化污泥的裝置如圖1所示。整個馴化過程均由時控開關控制，有效體積為12 L，排水比為1∶1，反應周期為6 h，每天運行4個周期，包括好氧進水(30 min)、曝氣(270 min)、沉淀(30 min)、出水(10 min)、靜置(20 min)。馴化過程中定期排泥，保持污泥質量濃度在4 000 mg/L左右。反應過程控制DO質量濃度為2.5～3.0 mg/L，pH值為7.5～8.5。定期測定進出水的CODCr濃度、氨氮濃度、亞硝態氮濃度、硝態氮濃度。污泥馴化過程中詳細的進出水參數如圖2～圖3所示。馴化過程中系統出水穩定，CODCr去除率達90%以上，氨氮基本被完全去除且沒有亞硝態氮的積累，表明硝化污泥馴化完成。其中模擬廢水組分及質量濃度分別為：CH3COONa為320、480、640 mg/L；NH4Cl為190、290、380 mg/L；K2HPO4為58 mg/L；KH2PO4為24 mg/L；CaCl2·H2O為67 mg/L；MgSO4·7H2O為42 mg/L；EDTA-2Na為42 mg/L；NaHCO3為1 000 mg/L；FeCl3·6H2O為30 mg/L；H3BO3為3 mg/L；CuSO4·5H2O為0.6 mg/L；KI為0.6 mg/L；NaMoO4·2H2O為1.2 mg/L；MnCl·4H2O為2.4 mg/L；ZnSO4·7H2O為2.4 mg/L；CoCl2·6H2O為3 mg/L。

圖1 污泥馴化裝置示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Sludge Acclimation Unit

圖2 污泥馴化過程中反應器CODCr的去除性能變化Fig.2 Changes of CODCr Removal Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

圖3 污泥馴化過程中反應器的脫氮性能變化Fig.3 Change of Denitrification Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

1.2.2 硝化污泥系統性能研究

本試驗在3個完全相同的SBR反應器中進行，SBR反應器有效體積為4 L。接種污泥來自上述馴化過的硝化污泥，污泥質量濃度在4 000 mg/L左右，污泥體積指數(SVI)為65%，具有良好的硝化活性和沉降性能。反應器采用與污泥馴化階段一樣的工況參數，進水CODCr質量濃度控制在500 mg/L左右，氨氮質量濃度控制在100 mg/L左右。3個反應器投加不同質量濃度的抗生素，分別為0.1、1.0、10.0 mg/L，保證其他的操作條件和進水水質不變。系統投加SMX運行30 d后，在反應周期內的不同時間點(0、1、2、3、4、5 h)測定出水中SMX濃度，以考察系統中SMX的去除效能，同時為了考察污泥對SMX的吸附，對反應5 h時污泥中SMX濃度進行檢測，并計算其污泥吸附率[9]。通過SMX的質量守恒，計算SMX的污泥吸附率Q、生物降解率R，計算如式(1)～式(2)，并測定出水中的CODCr及氨氮濃度，用于考察不同濃度的SMX對硝化污泥系統中CODCr去除及氨氧化進程的影響。

Q=C污泥/C進水×100%

(1)

R=[1-(C污泥+C出水)/C進水]×100%

(2)

其中：C污泥——污泥中SMX的質量濃度，mg/L；

C進水——進水中SMX的質量濃度，mg/L；

C出水——出水中SMX的質量濃度，mg/L。

1.2.3 微生物群落結構分析

系統運行30 d后，分別取3個反應器的污泥樣本800 μL，用DNA提取試劑盒(TIANamp soil DNA Kit，天根)提取總DNA，利用Illumina NovaSeq平臺(諾禾致源基因公司)，進行16S rRNA高通量測序，以分析硝化污泥系統中不同SMX濃度條件下的微生物量及微生物群落結構。為了測定微生物群落結構，選擇16S rRNA 基因的V4～V5可變區作為測序區域，對其進行擴增，相應的引物序列如表1所示。其中，16S rRNA 基因是基于RDP 分類軟件(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)，利用GreenGene數據庫(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)進行注釋。

1.3 分析方法

CODCr采用重鉻酸鉀滴定法測定；氨氮、亞硝態氮、硝態氮分別采用國標法中的鈉氏試劑分光光度法、紫外分光光度、分光光度法進行測定；抗生素樣品經0.22 μmol/L濾膜過濾后利用高效液相色譜儀(日本，島津)進行分析，流動相比例為甲醇∶1‰乙酸=9∶1，流速為0.8 mL/min，進樣量為20 μL，檢測結束后根據其峰值計算樣品中的SMX濃度。

利用qPCR對16S rRNA進行定量，在Applied biosystem Q1系統上進行，qPCR的反應條件為：94 ℃ 預變性 5 min、94 ℃變性 30 s、60 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 1 min，39 個循環，72 ℃延伸10 min。

圖4 不同濃度SMX下系統對SMX的去除Fig.4 Removal of SMX in the System under Different Concentrations of SMX

2 結果與討論

2.1 SMX的去除

如圖4所示，本研究探究了批次試驗中，硝化污泥系統對不同質量濃度的SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除。質量濃度為0.1、1.0、10.0 mg/L下，SMX的去除速率分別為0.019、0.193、1.927 mg/(L·h),5 h后的去除率分別為93.60%、91.54%、89.22%。結果表明，SMX在3個反應器的去除率均能達到90%左右，這說明硝化污泥系統能夠有效去除SMX，并且去除速率隨SMX濃度的升高而升高，這可能是因為污泥對較高濃度的SMX吸附速率較快。

如圖5所示，3個反應器中反應5 h后SMX的污泥吸附率分別為33.3%、31.2%、30.1%，生物降解率為60.3%、60.3%、59.1%。該結果表明SMX的去除主要依靠生物降解，這與文獻[10-11]中的結果一致。硝化污泥系統中的氨氧化細菌和功能細菌共同促進了SMX的去除，具體分析見2.3.4小節。

圖5 系統對SMX的吸附率和生物降解率Fig.5 Adsorption Rate and Biodegradation Rate of SMX in the System

2.2 SMX對硝化污泥系統性能的影響

2.2.1 SMX對CODCr去除的影響

如圖6所示，探究了批次試驗中不同濃度SMX對CODCr去除的影響。在0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX質量濃度條件下，CODCr的去除速率和5 h后的去除率分別為100.80、95.39、95.93、91.27 mg/(L·h)和95.76%、92.98%、94.90%、92.50%。值得注意的是，系統經過30 d的運行，即使在10.0 mg/L的SMX質量濃度下，CODCr的去除率仍高達92%。同樣，吳偉民[13]在研究SMX馴化的不同污泥系統對CODCr去除情況時發現，在10 mg/L SMX硝化污泥系統中，CODCr的去除率能高達90.20%。可見，硝化污泥系統能夠較好適應SMX的壓力沖擊。

2.2.2 SMX對氨氧化進程的影響

不同濃度SMX下系統的氨氧化進程如圖7所示。0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX質量濃度下氨氮的去除速率分別為20.78、20.56、20.50、19.67 mg/(L·h),5 h后的去除率分別為99.99%、99.53%、98.02%、95.11%。與未加SMX系統相比，0.1、1.0 mg/L SMX下系統的氨氮去除速率和去除率沒有明顯變化，而10.0 mg/L SMX對氨氮去除的影響較大。這主要是因為較高濃度的SMX會對系統中硝化細菌產生抑制作用，這與楊騰飛等[14]的研究結果一致。雖然不同濃度SMX對氨氧化進程有一定程度的影響，但SMX濃度的增加并未顯著影響氨氮的去除率，氨氮去除率均高于95%。這說明硝化污泥系統抗SMX沖擊負荷能力較強，與CODCr去除的結論一致。

圖7 不同濃度SMX下系統對氨氧化進程的影響Fig.7 Effect of the System on the Process of Ammonia Oxidation under Different Concentrations of SMX

2.3 SMX對硝化污泥系統中微生物群落的影響

2.3.1 微生物量的變化

研究[12]表明，16S rRNA可代表總微生物量。本研究對硝化污泥系統中不同SMX壓力下的16S rRNA基因拷貝數進行了測定。如圖8所示，隨著SMX濃度的增多，硝化污泥系統中微生物量呈現逐漸減少的趨勢，未投加SMX的硝化污泥系統中16S rRNA的基因濃度最高達到2.47×109copies/μL。這說明抗生素SMX抑制了系統中微生物的活性，從而導致微生物量的減少，并且抗生素SMX的濃度越高，對硝化污泥系統中微生物的毒性越大。

圖8 不同濃度SMX下系統中16S rRNA濃度的變化Fig.8 Changes of 16S rRNA Concentration in the System under Different Concentrations of SMX

2.3.2 Alpha多樣性指數分析

利用高通量測序技術對硝化污泥樣本進行了Alpha多樣性分析，分析結果如表2所示。Alpha多樣性包括OTUs、Shannon、Simpson、Chao1、ACE等多種指數，可以多角度反映樣品中微生物群落多樣性的差異情況[15]。由表2可知，OTUs、Shannon、Simpson指數均呈現隨著抗生素SMX濃度增大而減小的趨勢，抗生素SMX直接影響了硝化污泥中微生物群落的多樣性和均勻度。這時SMX持續產生選擇性壓力，無法耐受SMX的微生物逐漸死亡，導致多樣性的減少。由Chao1指數和ACE指數可知，0.1、1.0 mg/L SMX系統中的微生物群落相對豐度要高于其他系統，并且1.0 mg/L SMX系統中微生物群落相對豐度最高，10.0 mg/L SMX系統中最低。這是因為經過一段時間的馴化，適宜濃度的SMX可以提高系統中微生物群落的豐富度。而SMX濃度過高，導致一些微生物無法適應而死亡，造成微生物豐富度的降低。

表2 Alpha多樣性指數Tab.2 Alpha Diversity Indices

2.3.3 門水平上的菌群變化

系統中微生物在門水平上的種類和相對豐度如圖9所示。在各硝化污泥樣本中變形菌門(Proteobacteria)是相對豐度最高的菌門，占50%以上。該結果說明SMX的投加及其濃度變化并未對Proteobacteria的相對豐度產生顯著影響。研究[16-17]表明，Proteobacteria含有能夠降解芳香族污染物的細菌，在活性污泥中具有極為重要的作用，是常見的優勢菌。擬桿菌門(Bacteroidota)是不同SMX濃度的污泥樣本中另外一種優勢菌門，其豐度隨著抗生素濃度的升高而不斷升高。產生這種現象的原因是由于Bacteroidota中大多數細菌為化能自養型，它們能夠降解復雜的有機物，SMX濃度的提高為它們提供了足夠的碳源和能源。綜上，在不同抗生素SMX壓力下，硝化污泥系統中微生物的群落結構發生了顯著的變化。

圖9 不同SMX濃度樣本中門水平上菌群的相對豐度Fig.9 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

2.3.4 屬水平上的菌群變化

微生物菌群在屬水平上相對豐度的變化如圖10所示。由圖10可知，抗生素SMX濃度越高，其對微生物群落的影響越大。亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、unidentified_Nitrospiraceae、球衣菌屬(Sphaerotilus)、動膠菌屬(Zoogloea)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)的相對豐度在0.1、1.0 mg/L的SMX的硝化污泥樣本中較高，Nitrosomonas、Nitrospiraceae是常見的氨氧化細菌，其分泌的氨單加氧酶可以共代謝降解多種抗生素[5,18-19]，Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga均有降解有毒物質和有機物的能力[20-21]。因此，氨氧化細菌(Nitrosomonas、Nitrospiraceae)和優勢菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促進了0.1、1.0 mg/L SMX的去除。而在10.0 mg/L SMX的污泥樣本中，氨氧化細菌豐度較低，這與上述10.0 mg/L的SMX影響氨氧化進程結果一致(圖7)。另外，優勢菌屬[陶厄氏菌屬(Thauera)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)]隨著SMX濃度的增大，其相對豐度呈現逐漸升高的趨勢。研究[22]發現Thauera能夠降解芳香族污染物，Azoarcus可以代謝苯系污染物，而SMX是一種含有芳香結構的抗生素，推測Thauera和Azoarcus是一種SMX降解菌。Flavobacterium可以降解多種抗菌藥物，其可能對磺胺類抗生素也存在一定的降解能力。因此，Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。

圖10 不同SMX濃度樣本中屬水平上菌群的相對豐度Fig.10 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

3 結論

(1)硝化污泥系統能夠有效去除SMX，不同濃度SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除率均能達到90%左右。其中，SMX主要是通過生物降解去除的。

(2)不同濃度SMX系統中CODCr和氨氮的去除率均高于90%，硝化污泥系統抗SMX沖擊負荷能力較強。

(3)不同SMX壓力會顯著地影響硝化污泥系統中微生物群落結構。Proteobacteria和Bacteroidota是不同污泥樣本中的優勢菌門，氨氧化細菌(Nitrosomonas、unidentified_Nitrospiraceae)和優勢菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促進了0.1、1.0 mg/L SMX的去除，而Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。