胍基化殼聚糖季銨鹽的制備及其抗菌性能

王林，辛梅華，李明春，雷嘉華

(華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門 361021)

聚六亞甲基雙胍(PHMB)由于水溶性高、化學性質穩定、抗菌活性優異和毒性低等優點，在胍鹽中占有突出的地位[1].PHMB在生理pH值下具有高的正電荷，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和白色念珠菌都有療效，用PHMB處理傷口還有利于傷口愈合[2].目前，PHMB常用于添加到水凝膠中，賦予水凝膠抗菌性能[3-5]，以制備抗菌涂層[1，6-7].PHMB在水中具有良好的溶解性能，附著在材料表面的耐久性差，為解決這一問題，Song等[8]首先合成丙烯酸-PHMB，通過碳碳雙鍵和羥基的加聚反應接枝到纖維素上，制備的纖維素膜對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)具有良好的抑制作用.

天然高分子殼聚糖具有良好的生物相容性、可降解性和廣譜抗菌性[9]，但是，殼聚糖的溶解性限制了其應用.殼聚糖季銨化改性不僅可以提高殼聚糖的溶解性能，還可以提升殼聚糖的抗菌性能，擴展殼聚糖的應用[10].Oyervides-Muoz等[11]將制備的苯扎溴銨、溴化吡啶和溴化三乙基銨分別與殼聚糖進行接枝反應得到3種不同的殼聚糖季銨鹽，抗菌結果表明，殼聚糖季銨鹽的抗菌性能顯著提高.Wang等[12]在殼聚糖季銨鹽(HACC)緩沖液中添加PHMB制備復合抗菌劑，抗菌實驗和細胞毒性結果表明，復合抗菌劑的抗菌效果和生物安全性均優于單一的HACC或PHMB.Abri等[13]通過肝素和殼聚糖之間的離子相互作用制備載PHMB的納米粒子，PHMB的持續可控釋放超過10 d，制備的載藥納米粒子可以直接殺死革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌.Xu等[14]將殼聚糖和PHMB固定在聚丙烯腈納米纖維上，得到具有耐洗性和持久抗菌活性的納米纖維.

為提高季銨化殼聚糖的抗菌性能，本文將聚六亞甲基雙胍接枝到N-(2-羥丙基-3-甲基氯化銨)殼聚糖(HTCC)上，制備胍基殼聚糖季銨鹽(HCP)，并測定產物的最低抑菌質量濃度和抑菌率.

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

殼聚糖(CS，分子質量為50 ku，脫乙酰度為89%)，山東省青島市海匯生物工程有限公司；2，3-環氧丙基-3-甲基氯化銨(ETA)，山東省東營市國豐精細化工有限公司；聚六亞甲基雙胍(PHMB)，北京市桑普生物化學技術有限公司；三聚氯氰(TCT)、N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，上海市安耐吉化學技術有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺(TEA)，上海市國藥集團化學試劑有限公司；1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、瓊脂、蛋白胨、酵母浸粉，上海市阿拉丁生化科技有限公司.其他試劑為市售分析純.

IS50型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；AVANCE Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；Vario MICRO cube型元素分析儀，德國Elementar公司；FD-1B-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司.

1.2 胍基殼聚糖季銨鹽的制備

1.2.1 殼聚糖季銨鹽的制備 將25.0 g ETA溶解在20 mL水中得ETA溶液，5.0 g殼聚糖溶解在200 mL體積分數為2%的醋酸水溶液中，將ETA溶液緩慢滴加到殼聚糖溶液中，升溫至70 ℃，恒溫反應8 h，蒸餾水透析，冷凍干燥得N-(2-羥丙基-3-甲基氯化銨)殼聚糖(HTCC).

1.2.2 殼聚糖季銨鹽接枝聚六亞甲基雙胍的制備 采用正交實驗法對殼聚糖季銨鹽接枝聚六亞甲基雙胍的反應條件進行優化，接枝反應的正交因素水平，如表1所示.表1中:t1，t2分別為第一、第二階段反應時間；n(HTCC)∶n(TCT)為HTCC和TCT的物質的量之比；m(HTCC)∶m(PHMB)為HTCC和PHMB的質量比；θ為第二階段反應溫度.

表1 正交因素水平表Tab.1 Table of orthogonal factor level

取5 mL DMF置于燒瓶中，0～5 ℃下加入0.36 g TCT，完全溶解后，滴加0.76 g PHMB溶液，用縛酸劑調節反應的pH值使之維持在中性，恒溫反應8 h，得溶液1.稱取0.24 g HTCC溶解在30 mL水中，將溶液1加入HTCC溶液中，調節pH值使之維持在中性，40 ℃反應14 h，透析后冷凍干燥得到胍基殼聚糖季銨鹽(HCP).HCP的制備路線，如圖1所示.

圖1 HCP的制備路線Fig.1 Preparation route of HCP

1.3 元素分析(EA)

殼聚糖及其改性產物在80 ℃真空干燥至恒質量，采用Vario MICRO cube型元素分析儀進行測定.殼聚糖的脫乙酰度(DD)和殼聚糖季銨鹽的季銨化取代度(DS)通過C的質量分數w(C)和N的質量分數w(N)之比計算.由于PHMB是聚合物，胍基殼聚糖季銨鹽的胍基化取代度無法通過w(C)/w(N)計算得出，因此，用N的質量分數的變化表示[15].

1.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

采用溴化鉀壓片法，在IS50型傅里葉變換紅外光譜儀上測定殼聚糖及其改性產物的紅外光譜，掃描范圍為4 000～500 cm-1，掃描32次.

1.5 核磁共振氫譜(1H NMR)分析

PHMB、殼聚糖季銨鹽和胍基殼聚糖季銨鹽溶解在D2O中，用AVANCE Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀測定產物的1H NMR，測定溫度為22 ℃，采樣64次，弛豫時間為2 s.

1.6 抗菌性能測試

1.6.1 培養基的配制 LB液體培養基的配制[10]：取1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母浸粉，1.0 g氯化鈉至錐形瓶中，加入100 mL去離子水溶解，用濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液調節pH值至7.0，固體培養基另加入2.0 g瓊脂，高溫滅菌后使用.

1.6.2 最低抑菌質量濃度和最低殺菌質量濃度 冷凍保存的菌液先在37 ℃搖床中培養18～24 h，再用梯度稀釋法稀釋菌液備用.將樣品溶解在無菌水中，配制質量濃度為5.0 mg·mL-1的樣品溶液，倍半稀釋后，各取100 μL依次加入96孔板中，然后在各孔中加入100 μL稀釋后的菌液.將96孔板放置在37 ℃培養18 h，觀察濁度，取無明顯濁度變化對應的質量濃度記為該樣品的最低抑菌質量濃度(ρMI)，設置3組平行實驗.取大于最低抑菌質量濃度的孔板中的混合液100 μL涂覆在瓊脂板培養基上，37 ℃培養18 h，瓊脂板上菌落數小于或等于5個對應的質量濃度記為最低殺菌質量濃度(ρMB).

1.6.3 抑菌率測定 無菌水配制樣品溶液，樣品質量濃度分別為5.0，2.0，1.0 mg·mL-1.取等體積的樣品溶液和稀釋后的菌液混勻后置于搖床中動態培養30 min，取100 μL混合液均勻涂覆在瓊脂板上，以無菌水為對照組，37 ℃培養18～24 h，讀取各培養皿上細菌的菌落數，根據菌落數計算抑菌率，重復3次取平均值.抑菌率的計算公式為

2 實驗結果與討論

2.1 不同反應條件對聚六亞甲基雙胍取代度的影響

由于PHMB聚合物中N的質量分數較高，將PHMB接枝到HTCC上得到的產物中N的質量分數也隨之增加.采用正交實驗，以產物中N的質量分數為指標，通過各水平對應的N的質量分數的平均值間接選擇最佳反應條件，最后綜合考慮取代度和生產成本得出最佳的反應條件[16].不同反應條件下制備的胍基殼聚糖季銨鹽的實驗結果，如表2所示.

表2 不同反應條件下制備的HCP的實驗結果Tab.2 Experimental results of HCP prepared under different reaction conditions

不同反應條件對HCP取代度的影響，如圖2所示.由圖2(a)可知:三聚氯氰和PHMB發生一取代的取代度隨著反應時間的延長而增大；前4 h，隨著反應時間的延長，反應速率增加較快，4 h后反應速率增加緩慢.這是因為初始溶液中單體質量濃度較高，分子之間發生碰撞的幾率較大；隨著反應時間的延長，溶液中單體逐漸被消耗，反應速率逐漸降低.因此，選擇第一階段反應時間為8 h.

(a) 第一階段反應時間 (b) n(HTCC)∶n(TCT)

(c) m(HTCC)∶m(PHMB) (d) 縛酸劑

(e) 第二階段反應時間 (f) 第二階段反應溫度圖2 不同反應條件對HCP取代度的影響Fig.2 Effect of different reaction conditions on substitution degree of HCP

由圖2(b)可知:HTCC和TCT的最佳物質的量之比為1.0∶2.5.在實驗過程中，PHMB溶解在水中，三聚氯氰在水溶液中會發生一定程度的水解而被消耗，生成三聚氰酸[17]，因此，反應過程中三聚氯氰應適當過量，但過量太多會造成原料的浪費.

由圖2(c)可知:HTCC和PHMB的質量比對取代度的影響最大；隨著PHMB質量的增加，取代度呈增大趨勢；當m(HTCC)∶m(PHMB)達到1.0∶1.2時，進一步增大PHMB的量，由于反應位阻的增大，取代度增加不大.因此，選取HTCC和PHMB的質量比為1.0∶1.2.

縛酸劑在一定程度上會影響PHMB的取代度.由圖2(d)可知:三乙胺的縛酸效果高于其他縛酸劑.這是因為DIPEA，DMAP，TEA等均會和TCT發生反應，在縛酸的同時也會和原料發生反應[18]，從而影響PHMB的取代度.因此，選擇實驗的最佳縛酸劑為TEA.

由于位阻的影響，三聚氯氰發生二取代的溫度需適當增加[19].由圖2(e)，(f)可知：最佳反應時間為14 h，最佳反應溫度為40 ℃；隨著第二階段反應溫度和反應時間的增加，取代度呈現先增加后減小的趨勢.這是因為反應以水為溶劑，三聚氯氰在水溶液中會發生部分水解，隨著溫度的升高和反應時間的延長，三聚氯氰的水解程度加劇[10].

2.2 元素分析

采用元素分析儀對殼聚糖、殼聚糖季銨鹽和胍基殼聚糖季銨鹽進行測定，殼聚糖衍生物的元素分析結果，如表3所示.表3中：w(H)為H的質量分數.由表3可知：殼聚糖的脫乙酰度為86.00%；殼聚糖季銨鹽的季銨化取代度為43.59%；胍基殼聚糖季銨鹽中N的質量分數為15.51%，高于殼聚糖季銨鹽中N的質量分數.

表3 殼聚糖衍生物的元素分析與取代度Tab.3 Elemental analysis and substitution degree of chitosan derivatives

2.3 FTIR分析

圖3 CS，HTCC和HCP的FTIR圖Fig.3 FTIR spectra of CS，HTCC and HCP

采用溴化鉀壓片法，在IS50型傅里葉變換紅外光譜儀上測得CS，HTCC和HCP的紅外光譜，如圖3所示.圖3中：ν為波數.

由圖3可知：與CS相比，HTCC的紅外光譜圖中，1 477 cm-1處出現明顯的尖峰為季銨鹽中甲基的C-H彎曲振動峰，且在1 599 cm-1處的伯胺N-H的彎曲峰減弱，表明季銨鹽基團已引入到殼聚糖的氨基上[20]；在HCP的紅外光譜圖中，1 604和1 587 cm-1處的吸收峰為C=N的伸縮振動和N-H的彎曲振動[8]，2 921和2 853 cm-1處出現的吸收峰為飽和甲基和亞甲基的伸縮振動峰，在720 cm-1處出現了(-CH2-)n(n≥4)基團的特征吸收峰[21]，表明PHMB已通過三聚氯氰橋梁接枝到HTCC上.

2.4 1H NMR分析

PHMB，HTCC和HCP的1H NMR譜圖，如圖4所示.圖4中：δ為化學位移.由圖4可知：4.70對應的是溶劑D2O的特征峰；在PHMB的1H NMR譜圖中，3.03處出現的特征峰為PHMB與氨基相連的亞甲基的質子峰，1.40和1.20處的特征峰對應的是遠離氨基的4個亞甲基的質子峰；在HTCC的1H NMR譜圖中，3.14處出現的尖而強的峰為三甲基季銨鹽中甲基的質子峰，1.95處的特征峰為殼聚糖中未脫除乙酰氨基上的甲基質子峰[20]；在HCP的1H NMR譜圖中，與圖4(b)相比，在1.40和1.20處出現PHMB的特征吸收峰，表明胍基已接枝到殼聚糖季銨鹽上.由1H NMR譜圖進一步說明已制得胍基殼聚糖季銨鹽.

(a) PHMB (b) HTCC (c) HCP 圖4 PHMB，HTCC和HCP的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra of PHMB，HTCC and HCP

表4 HTCC和HCP的ρMI和ρMB Tab.4 ρMI and ρMB of HTCC and HCP

2.5 抗菌性能

2.5.1 最低抑菌、最低殺菌質量濃度 最低抑菌質量濃度通常用來評價樣品對微生物的生長抑制效果.測得兩種殼聚糖衍生物HTCC和HCP對E.coli和S.aureus的最低抑菌質量濃度(ρMI)和最低殺菌質量濃度(ρMB)，如表4所示.

由表4可知：HTCC和HCP對E.coli的最低抑菌質量濃度分別為0.625，0.020 mg·mL-1，對S.aureus的最低抑菌質量濃度分別為0.020，0.005 mg·mL-1；而HTCC和HCP對E.coli的最低殺菌質量濃度分別為2.500，0.156 mg·mL-1，對S.aureus的最低殺菌質量濃度分別為0.156，0.010 mg·mL-1.結果表明，HCP的最低抑菌質量濃度明顯低于HTCC，說明PHMB的引入顯著提高了HTCC對兩種細菌生長的抑制作用.這是因為PHMB具有高活性和正電荷，增加了殼聚糖的電荷密度，容易被帶負電荷的微生物吸收，進而抑制細菌的活性[8].HTCC和HCP對S.aureus的抑菌效果優于對E.coli的抑菌效果，這可能與細菌的結構有關，E.coli的外殼由外膜和內膜組成，兩層膜之間有肽聚糖，而S.aureus由于缺乏外膜，更有利于抗菌劑的進攻，容易被破壞，導致內溶物流出，從而使細菌死亡[22].

2.5.2 抑菌率 為進一步評價HTCC和HCP的抗菌活性，分別測定了不同質量濃度(ρ)下HTCC和HCP對E.coli和S.aureus的抑菌率(η)，結果如圖5所示.

由圖5可知：HTCC的抑菌效果較差，尤其是對E.coli，當HTCC的質量濃度為1.0 mg·mL-1時，對E.coli的抑菌率為18.2%，當HTCC的質量濃度達到2.5 mg·mL-1時，其抑菌率僅為39.3%；HTCC對S.aureus的抑菌效果稍優于E.coli，且抑菌率隨著HTCC質量濃度的增加而增加，當HTCC的質量濃度為1.0 mg·mL-1時，對S.aureus的抑菌率為18.7%，當HTCC的質量濃度達到2.5 mg·mL-1時，其抑菌率可達73.3%，這與最低抑菌質量濃度的結果一致.HTCC接枝PHMB后，可以明顯增加其抑菌能力；質量濃度為0.5 mg·mL-1的HCP對E.coli的抑菌率為81.1%，當HCP質量濃度增加到1.0 mg·mL-1時，其對E.coli的抑菌率可達89.8%；質量濃度為0.5 mg·mL-1的HCP對S.aureus的抑菌率可達96.1%，質量濃度為1.0 mg·mL-1的HCP對S.aureus的抑菌率為100%，均高于相同質量濃度下HTCC的抑菌率，這與表4的測定結果一致.

(a) E. coli (b) S. aureus圖5 HTCC和HCP對E. coli和S. aureus的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of HTCC and HCP on E. coli and S. aureus

3 結論

以N-(2-羥丙基-3-甲基氯化銨)殼聚糖和聚六亞甲基雙胍為原料，三聚氯氰為橋梁，制備胍基殼聚糖季銨鹽衍生物，采用元素分析、傅里葉變換紅外光譜和核磁共振波譜對產物的結構進行表征，并測定其抗菌性能.正交實驗結果表明，胍基殼聚糖季銨鹽的最佳反應條件為HTCC和TCT的物質的量比1.0∶2.5，HTCC和PHMB的質量比1.0∶1.2，縛酸劑為三乙胺，三聚氯氰一取代的反應時間8 h，二取代的反應時間14 h，反應溫度40 ℃.

抗菌性能測定結果表明，殼聚糖季銨鹽經胍基化改性后，可以明顯提高其抗菌效果；質量濃度為1.0 mg·mL-1的HCP對E.coli和S.aureus的抑菌率分別為89.8%和100.0%，高于相同質量濃度下HTCC對E.coli和S.aureus的抑菌率18.2%和18.7%.胍基化殼聚糖季銨鹽優異的抗菌性能在環境消毒、抗菌紡織面料開發等領域具有潛在的應用前景.