玉米赤霉烯酮液相色譜法與酶聯(lián)免疫法測定結(jié)果分析

熊永莉，王生華，康 平，洪維暉，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荊門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，湖北 荊門 448000）

1 ?課題研究背景

玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，能造成動物急慢性中毒，引起動物繁殖機能異常甚至死亡，可給畜牧場造成巨大經(jīng)濟損失。因此，國家將其列入食品衛(wèi)生安全監(jiān)測的必檢項目。目前，檢測機構和相關企業(yè)一般采用液相色譜法和酶聯(lián)免疫法測定其含量。其中液相色譜法為國家規(guī)定的標準方法。液相色譜法雖然測定結(jié)果準確，但其測定方法較為復雜，對儀器要求高，成本大，耗時長，嚴重影響了生產(chǎn)經(jīng)營活動的正常開展。酶聯(lián)免疫法具有操作簡單，檢測時間短，顯著節(jié)約成本的特點。本研究旨在對以上兩種方法檢測結(jié)果進行比較，驗證酶聯(lián)免疫法測定結(jié)果與液相色譜法測定結(jié)果是否一致，從而得出酶聯(lián)免疫法的適用性和推廣應用價值。

2 ?實驗過程與步驟

課題研究小組人員分成兩組，對4個含有不同濃度玉米赤霉烯酮的樣品分別用酶聯(lián)免疫法和液相色譜法進行玉米赤霉烯酮含量測定。4個樣品分別為：樣品1：小麥標準物質(zhì)玉米赤霉烯酮含量為58ug/kg±9ug/kg；樣品2：小麥標準物質(zhì)玉米赤霉烯酮含量為95ug/kg±12ug/kg；樣品3：自備空白基質(zhì)加標樣品，玉米赤霉烯酮加標濃度為20ug/kg；樣品4：自備空白基質(zhì)加標樣品，玉米赤霉烯酮加標濃度為150ug/kg。一組實驗人員做酶聯(lián)免疫法，另一組實驗人員做液相色譜法，兩種實驗方法具體如下：

2.1 ?酶聯(lián)免疫法（某生物技術有限公司生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒）

2.1.1 ? 原理

采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被玉米赤霉烯酮抗原，樣本中玉米赤霉烯酮和此抗原競爭玉米赤霉烯酮的抗體（抗試劑），同時玉米赤霉烯酮抗體與酶標二體（酶標物）相結(jié)合，經(jīng)底物顯色，樣本吸光值與其含有的玉米赤霉烯酮呈負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中玉米赤霉烯酮的含量。

2.1.2 ?設備及試劑

酶標儀（檢測波長450nm）、振蕩器、旋渦儀、天平（精度：0.01g）、離心機、離心管、定量濾紙和漏斗、微量移液器、去離子水、甲醇。

2.1.3 ?溶液的配制

配液1：60%甲醇

用去離子水將甲醇按3：2體積比進行稀釋。

配液2：樣本稀釋液

用去離子水將玉米赤霉烯酮濃縮樣本稀釋液按1：19體積比進行稀釋。

配液3：洗滌液

用去離子水將濃縮洗滌液按1：9體積比進行稀釋。

2.1.4 ?樣品前處理

（1）粉碎并稱取5.0g有代表性的樣品，加入60%的甲醇50ml與其混合；

（2）于振蕩器上劇烈震蕩10min，轉(zhuǎn)速為150r/min（手搖或者旋渦均需5min）；

（3）取液體于4000r/min離心5min（或者靜置3min，再用定量濾紙過濾）；

（4）取上清或濾液0.5ml，再加入4.5ml去離子水；

（5）振蕩5s或手搖勻，取50ul進行分析。

稀釋倍數(shù)：100倍

2.1.5 ? 檢測

（1）將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上。

（2）取出需要數(shù)量的微孔板，并記錄下各標準品和樣品的位置，建議均做雙孔平行，未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2～8℃環(huán)境，切勿冷凍；

（3）加標準品/樣品溶液50ul到對應的微孔中，在每孔加入50ulZEN酶標物，最后加入50ulZEN抗試劑。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應30min；

（4）揭開蓋板膜，倒掉板孔中液體，在每孔加入250ul洗滌液，充分洗滌4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；

（5）在每孔中加入底物液A，再加底物液B，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應15min；

（6）揭開蓋板膜，在每孔中加入50ul終止液，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，設定酶標儀在450nm下讀取酶標板吸光度值。

2.2 ?液相色譜法（食品安全國家標準?食品中玉米赤霉烯酮的測定?GB?5009.209—2016第一法）

2.2.1 ? 原理

用乙腈溶液提取試樣中的玉米赤霉烯酮，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜熒光檢測器測定，外標法定量。

2.2.2 ?儀器和設備

（1）高效液相色譜儀：配有熒光檢測器。

（2）高速粉碎機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。

（3）均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。

（4）高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速18000～22000r/min。

（5）氮吹儀。

（6）空氣壓力泵。

（7）玻璃注射器：10ml。

（8）天平：感量0.0001g和0.01g。

2.2.3 ?材料和試劑

（1）材料：玉米赤霉烯酮免疫親和柱（柱規(guī)格1ml或3ml，柱容量≥1500ng，或等效柱。）玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5um，無熒光特性。

（2）試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20、鹽酸。

2.2.4 ?樣品前處理

（1）提取。稱取40.0g粉碎試樣（精確到0.1g）于勻質(zhì)杯中，加入4g氯化鈉和100ml提取液，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min，定量濾紙過濾。移取10.0ml濾液加入40ml水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。

（2）凈化。將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準確移取10.0ml上述中的濾液，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至有部分空氣進入親和柱中。用5ml水淋洗柱子1次，流速為1～2滴/s，直至有部分空氣進入親和柱中，棄去全部流出液。準確加入1.5ml甲醇洗脫，流速約為1滴/s。收集洗脫液于玻璃試管中，于55℃以下氮氣吹干后，用1.0ml流動相溶解殘渣，供液相色譜測定。

2.2.5 ? 測定

將待測試樣溶液注入高效液相色譜儀，得到玉米赤霉烯酮的峰面積。由標準曲線得到試樣溶液中玉米赤霉烯酮的濃度。

3 ?檢測結(jié)果數(shù)據(jù)比較分析（見表1，表2，表3）

表1 ?酶聯(lián)免疫法測定結(jié)果統(tǒng)計表

表2 ?液相色譜法測定結(jié)果統(tǒng)計表

表3 ?兩種方法檢測結(jié)果與真實值的誤差統(tǒng)計表

4 ?實驗結(jié)論

通過對4個含有不同濃度玉米赤霉烯酮的樣品，分別用酶聯(lián)免疫法和液相色譜法進行玉米赤霉烯酮含量測定，分析比較實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，得出如下結(jié)論：

（1）兩種方法檢測結(jié)果技術指標均滿足實驗標準方法要求。用酶聯(lián)免疫法測定，4個樣品檢測結(jié)果回收率均在100%±30%范圍內(nèi)（見表1），滿足實驗要求；用液相色譜法測定，4個樣品檢測結(jié)果相對標準偏差均在15%范圍內(nèi)（見表2），符合標準要求。

（2）酶聯(lián)免疫法和液相色譜法測定結(jié)果比較存在一定的偏差，不是完全一致的。酶聯(lián)免疫法4個樣品檢測結(jié)果與樣品真實值之間誤差較大，相對偏差均超過5%（見表3）；液相色譜法4個樣品檢測結(jié)果與樣品真實值誤差很小，相對偏差均在5%以內(nèi)（見表3），結(jié)果準確可信。

（3）建議基層檢驗檢測機構和糧食企業(yè)可以運用酶聯(lián)免疫法進行初篩，提高檢測效率，降低檢測成本，方便生產(chǎn)和經(jīng)營。對于初篩結(jié)果值超過國家規(guī)定的限量值或需出具檢驗檢測報告的，則用液相色譜法進行測定，以確保檢測結(jié)果的準確性和權威性。