阿爾茨海默病大鼠模型建立與磁共振成像*

尹匯敏，郭宏，趙文靜，韓曉楠，金淼，崔紅升，程浩，王玥，孟鑫

（1.齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫院 放射科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 磁共振科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；4.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院 醫務科，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是一種以隱匿起病和進行性惡化為特征的神經變性病，臨床表現主要為認知障礙、精神行為異常和社會生活功能減退［1-2］，AD 病程長、不可逆且目前臨床無特效藥物，早期診斷并進行臨床干預可有效延緩其進展［3］，提高患者生存質量，減輕家庭及社會經濟負擔。目前研究中AD 僅能通過組織病理明確診斷（即β-淀粉樣蛋白沉積），缺乏活體診斷其特異性的生物學工具［4］。大鼠模型能夠復制出AD 的部分神經病理特征如神經纖維的變性和淀粉樣蛋白的沉積。往期文獻研究結果表明采用D-半乳糖聯合三氯化鋁建造的大鼠模型效果顯著，該建模方法不僅可以模擬出AD 相關的行為學改變，而且亦可出現類似人類AD 的神經病理學及病理生理學改變。此外，與其它動物模型相比該模型制作方法簡單、周期短且無創，有利于進一步的動物實驗研究［5］。

磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）可在無創條件下對活體大腦進行結構描述和體積測量［6-7］。最新高場強MRI 如7.0 T 小動物磁共振、9.4T 高場強高分辨率離體型磁共振也開始應用于AD 大鼠模型掃描［8-9］。最新研究發現：AD 大鼠建模完成后可進行氫質子磁共振波譜研究（proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS），利用1H-MRS 可檢測N-乙酰天門冬氨酸（N-acetyl aspartic acid,NAA）/肌酸（creatine,Cr）改變，有助于AD 早期臨床診斷［4］；APP/PS1 轉基因AD 小鼠在磁共振彌散張量成像（diffusion tensor imaging,DTI）中顯示其大腦白質腦區胼胝體、扣帶回、外囊等處出現各向異性分數（fractional anisotropy,FA）值的變化，反映了水分子在神經纖維中向不同方向擴散的差異性，從而達到活體內檢測大腦白質纖維束完整性，分析AD 早期對大腦白質的損害程度［10-11］；5XFAD 小鼠模型進行功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging,fMRI）以雙側海馬為感興趣區通過MateLab 平臺中SPM 軟件結合VBM 軟件分析發現在5XFAD 小鼠早期即存在海馬區組織微結構完整性受損，背側海馬區組織微結構完整性損害與其空間認知功能狀態相關［12］。由于多參數、多方位、多序列斷層成像的巨大優勢以及功能成像的高速發展，磁共振已經成為動物實驗研究中不可或缺的工具之一。但由于高場強小動物磁共振成本極高，大多科研院校及科研基地不具備此科研設備條件，設備的緊缺不利于AD 動物實驗的進一步研究發展。因此，本實驗擬通過D-半乳糖聯合三氯化鋁制備AD 大鼠模型，進行宏觀特征采集檢測大鼠行為表現，糖水偏好實驗、水迷宮行為學檢測確認建模結果，篩選出建模合格的大鼠與對照組大鼠同時進行顱腦磁共振掃描，經后臺三維重建測量分析確定建模后大鼠與對照組大鼠腦結構與腦體積差異，比較GE 3.0T 磁共振小動物線圈顱腦序列；Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描的圖像質量，提出適用于AD 大鼠顱腦掃描的醫用磁共振儀器和配套的線圈序列，為AD 大鼠的監測診斷提供影像參考依據，為AD 動物實驗的進一步發展提供有力的輔助診斷工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物為十二周齡SD 大鼠24 只（雌雄各半），雄鼠質量為（190±10）g，雌鼠質量為（170±10）g，購自齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院動物中心實驗室。所有大鼠均經過Morris 水迷宮篩選，運動力表現靈活、反應迅速。飼養溫度23℃，濕度30%～40%，光照量為12 小時黑白交替，通風良好，實驗組、對照組統一飼養于齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院動物中心實驗室。本實驗所有操作均符合動物保護與使用實驗操作規范，實驗人員持有哈爾濱市科學技術局頒發的實驗動物從業人員培訓合格證。D-半乳糖（D810318 180.16MW）三氯化鋁（A800394 133.34MW）購自上海麥克林生化科技有限公司；水合氯醛（CAS NO：302-17-0）購自福晨（天津）化學試劑有限公司；大鼠維持飼養飼料購自沈陽茂華生物科技有限公司；大鼠電子天平稱購自中科生命高精度測量稱；一級蔗糖購自南寧糖業股份有限公司明陽糖廠。

1.2 儀器與設備

鼠博士Morris 水迷宮：型號RD1101-MWM，中國上海移數信息科技有限公司；Philips 1.5 T 磁共振Micro 47 mm 顯微線圈，荷蘭飛利浦公司；GE 3.0 T 磁共振小動物線圈，型號Magtron Model WK602，美國GE 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠建模 所有大鼠適應性飼養1 周后，對照組和實驗組隨機分配各12 只（雌雄各半）。實驗組采用D-半乳糖聯合三氯化鋁連續8 周建模，建模方式為：上午腹腔注射生理鹽水配制的D-半乳糖溶液650 mg/（kg·d），下午灌胃生理鹽水配制的三氯化鋁550 mg/（kg·d）；對照組：上午腹腔注射等量生理鹽水，下午灌胃等量生理鹽水［5］，實驗組和對照組單鼠單籠同等條件飼養。氯化鋁活性較高，遇潮濕空氣易發生放熱反應，釋放大量煙和熱，具有腐蝕性，實驗過程中應做好個體防護。

1.3.2 糖水偏好實驗 造模8 周結束后所有大鼠正常飼養一天，測量大鼠體重并記錄。單籠飼養大鼠進行糖水偏好實驗：糖水（2%蔗糖）純凈水雙瓶供飲實驗組和對照組大鼠，由大鼠自由飲用且正常飼養不禁食，飲用24 小時后計算大鼠24小時內的糖水、純凈水消耗量，計算糖水偏好百分比=糖水消耗量/（糖水+純水）×100%，實驗結束后恢復正常飲水等待下一步實驗。

1.3.3 記憶行為學檢測（Morris 水迷宮）糖水偏好實驗結束一天后所有大鼠進行水迷宮記憶行為學測試，實驗時間為一周。實驗前將水池劃分為四個象限：東北、東南、西北、西南，并將透明站臺放置于西南象限，水應沒過站臺。并開啟水迷宮自帶加熱恒溫器使水保持恒溫（25±1）℃，厚簾子遮擋水池使水面無光影，并在固定位置放置黑色三角形參照物，實驗中用可食用黑色染料將水染成純黑，突出白色大鼠輪廓，并在每次實驗后將大鼠擦干，防止體溫降低大鼠產生應激性改變。實驗全程密切關注監視器，防止大鼠體力不支導致溺水。

隱蔽站臺試驗：第1 天適應性訓練，引導大鼠尋找水下隱藏站臺，訓練時間不計入實驗結果，引導大鼠找到站臺即結束訓練。每天實驗開始時將大鼠從任意象限一面池壁放入水中，設定尋找站臺時間限制為60～90 s，直至爬上隱藏站臺，記錄潛伏期時間（共六天，每天訓練四次），若大鼠60 s 內未找到站臺，可手動引導其爬上站臺并停留10～20 s。

空間探索試驗：上一實驗步驟結束24 h 后撤掉設置的站臺，隨后記錄大鼠120 s 內的游泳路徑，統計其在原隱藏站臺象限范圍內的停留時間和穿越原站臺象限次數。

1.3.4 磁共振成像 水迷宮檢測結束1 天后分別使用Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist序列、GE 3.0 T 磁共振頭頸部線圈垂體序列和動物線圈顱腦序列掃描所有大鼠，大鼠經5%水合氯醛麻醉呼吸平穩后俯臥位頭先進，行定位像掃描，調整至合適位置后行冠狀、矢狀、軸位T1WI、T2WI掃描。T1WI 參數為TE（echo time,TE）=90 ms，TR（repetition time）=1 000 ms，Averages=4，Slice Thickness=0.5 mm，Field of view=120 mm×120 mm，gap=0.4 mm，matrix=256×256。T2 加權像參數為TR=5 000 ms，TE=36 ms，Averages=4，Slice Thickness=0.5 mm，Field of view=120 mm×120 mm，gap=0.4 mm，matrix=256×256。數據經后臺PACS系統上傳至Philips Medical Systems 工作站軟件，采用盲法由兩位MRI 主任醫師手動勾勒相關腦區并進行分析比較大鼠腦結構改變情況，同時應用3D 重建成像測量大鼠腦體積。

1.4 統計學方法

采用上海移數公司大鼠行為學分析軟件分析并記錄各行為學指標，實驗數據用SPSS 23.0 軟件（SPSS,Inc,Chicago,IL,USA）和R3.3.0（http：//www.r-project.org/）分析，計量資料用均數±標準差（）表示，正態分布的水迷宮數據采用雙因素方差分析，非正態分布采用秩和檢驗來比較組間差異，P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖水偏好實驗結果

宏觀觀察發現實驗組大鼠毛發枯槁、畏光、活動力差，對照組一切正常。對照實驗開始前兩組大鼠稱重結果：雄鼠質量為（190±10）g，雌鼠質量為（170±10）g；建模結束后兩組大鼠稱重結果：對照組雄性：（306±8.72）g、雌性：（262±11.60）g，實驗組雄性：（270±7.65）g、雌性：（235±8.26）g，實驗組大鼠體重下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；糖水偏好百分比：對照組（82±5.03）%，實驗組為（63±12.67）%，兩組差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 水迷宮測試結果

第1 天適應性訓練不計入結果中，較之對照組，實驗組大鼠潛伏時間長，第6 天潛伏期實驗組為（15±14.3）s，對照組為（13±11.3）s，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1；撤去隱藏站臺以后停留原站臺象限內時間和穿越原站臺次數見表2。

表1 兩組潛伏期比較（n=12,,s）

表1 兩組潛伏期比較（n=12,,s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

表2 兩組停留原站臺時間與穿越次數比較（）

表2 兩組停留原站臺時間與穿越次數比較（）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

2.3 磁共振掃描結果

比較不同磁場線圈序列掃描結果：GE 3.0 T磁共振動物線圈、Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列顱腦結構清晰分辨率高。相較于對照組，實驗組大鼠腦溝明顯增寬，腦體積減低，尤以海馬腦體積減低為主，實驗組大鼠海馬頭部間距（ineteruncal distance,IUD）增寬為（32±2.36）mm，而對照組大鼠IUD 為（28±1.92）mm。Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描對照組大鼠冠狀位橫軸位磁共振像見圖1，GE 3.0 T 小動物線圈Magtron Model WK602 顱腦序列掃描實驗組大鼠冠狀位矢狀位橫軸位磁共振像見圖2，Philips 1.5 T Micro-47mm 線圈，GE 3.0 T Magtron Model WK602 小動物線圈見圖3。

圖1 對照組大鼠冠狀位橫軸位磁共振像

圖2 實驗組大鼠冠狀位矢狀位橫軸位磁共振像

圖3 兩組大鼠磁共振掃描所用線圈

3 討論

AD 是進行性認知功能障礙中樞神經系統退行性病變［13］，其早期確診率低且無特效治療藥物。據流行病學統計顯示，AD 逐漸成為威脅老年人認知及社會生活功能減退的主要病因之一［14］。其病因至今仍未明確，最受認可的β 淀粉樣蛋白（Aβ）級聯假說目前也出現了較大爭議［15-16］。確認病因并早期診斷AD 進行臨床干預有利于提高患者生存質量，減輕社會經濟負擔。動物模型可模擬患者的部分病理特征，為AD 的研究和發展提供了理想的模型。AD 模型的建立目前有較多方式和途徑，主要包括自然衰老型：24 月齡大鼠與臨床患者各種病理特征相似，但成本過高且衰老大鼠免疫力過低易導致死亡；轉基因動物模型：APP、PS1、ApoE 等轉基因動物模型認知功能障礙明顯，蛋白沉積不明顯；化學損傷動物模型：Aβ1-42 海馬區注射［17］，建模時間短且效果顯著，是近年來模型建立的主要手段，但由于該方法技術要求高，容易對腦組織造成不確定損傷，導致顱內血腫形成等缺點不利于磁共振圖像診斷。因此本研究選擇D-半乳糖聯合三氯化鋁進行AD 大鼠建模，D-半乳糖聯合三氯化鋁造模方法具有時間短、價格低、結果可靠穩定等優點。D-半乳糖可誘導體內脂質氧化應激、非酶糖基化反應產生自由基，使細胞代謝功能下降促使神經衰老［17-18］，鋁濃度的升高促使大腦內β-淀粉樣蛋白沉積、神經元變性凋亡等與AD 的發生發展密切相關，使動物發生學習記憶障礙的病理改變［19-22］。本研究中大鼠建模完成后經宏觀觀察發現實驗組大鼠毛發枯槁、畏光、活動力差、體重減輕，糖水偏好實驗、水迷宮行為學檢測分析與對照組比較其差異具有統計學意義（P＜0.05），證明D-半乳糖聯合三氯化鋁是有效的建模途徑。

磁共振成像因其無創、軟組織分辨率高等絕對優勢逐漸成為AD 早期診斷標記的有利工具，最新高場強MRI 如7.0 T 小動物磁共振、9.4 T 高場強高分辨率離體型磁共振也逐漸開始應用于AD 大鼠模型掃描［8-9］。但高場強小動物磁共振價格昂貴，大多科研基地不具備此科研設備條件，不利于AD 動物實驗的進一步研究發展。本研究經過前期多次預實驗，比較了AD 大鼠模型在GE 3.0 T小動物線圈顱腦序列、Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描的多層圖像發現Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描圖像結構清晰，易于分辨，可用于AD 大鼠模型診斷，可為動物實驗提供更簡易便捷的成像方式［21-22］。影像學可采用多種方法測量體積的大小，本研究以海馬頭部間距IUD 測量確定腦體積改變，測量方法是在冠狀面前聯合第一次出現的層面測量海馬頭部間的最短距離，IUD 增寬反應了海馬的萎縮，IUD 超過30 mm 即診斷為AD 大鼠［5］，這有助于對AD 大鼠模型的診斷和對病程的監測。磁共振數據經Philips Medical Systems 后處理工作站中三維分析3D 感興趣區測量比較發現：較之對照組，實驗組大鼠腦溝增寬。因大腦灰質皮層萎縮導致的大鼠腦溝增寬可為AD 大鼠的診斷提供依據。因此，我們認為Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列可能為AD 大鼠提供較高質量磁共振圖像。本研究基于以往研究結果并結合科室現有的醫療設備研究發現GE 3.0 T、Philips 1.5 T 不同場強磁共振儀器的不同線圈及掃描序列可得出較高質量大鼠顱腦磁共振圖像，這有助于進一步認識AD 大鼠病程中顱腦病變的發生發展及其相互聯系，可對AD 大鼠模型動物實驗及應用的影像技術后續研究提供客觀參考。

本研究創新之處在于對AD 模型大鼠采用醫用磁共振微線圈和動物線圈同時進行顱腦掃描，比較不同設備下實驗組和對照組大鼠腦結構和腦體積差異，認為Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈可為AD 大鼠動物學實驗提供有利的診斷。本研究亦存在一定的不足之處，即主觀評價法存在一定誤差，需要在后續的實驗中補充更精確的評價方法，同時應在今后的課題研究中通過增加AD 大鼠模型功能磁共振檢測：即灌注成像（perfusion weighted imaging,PWI）和磁敏感成像（susceptibility weighted,SWI）檢測灰質皮層萎縮腦血流灌注異常情況和淀粉樣蛋白沉積過程中引起的（Fe,Cu,Al）等金屬元素的沉積；氫質子波譜檢測N-乙酰天門冬氨酸/肌酸（NAA/Cr）的異常代謝；靜息態功能磁共振檢測AD 大鼠局部和全腦異常自發神經活動和腦區功能連接，更加深入的研究AD 大鼠顱腦改變在磁共振圖像上的表現。

綜上所述，D-半乳糖聯合三氯化鋁可建造有效的阿爾茨海默病大鼠模型，本研究呈現的Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈同GE3.0 T動物線圈均可清晰顯示大鼠腦結構，可用于阿爾茨海默病大鼠病程監測和診斷，可為動物實驗研究提供參考思路。