洗手產品除菌效果評價的離體試驗方法研究

孫廷麗， 李彩玲， 陳 靜， 葉一均， 林小涵， 楊義熙， 謝小保

廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室/農業農村部農業微生物組學與精準應用重點實驗室/農業農村部農業微生物組學重點實驗室/廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070

研究顯示，每年因使用不潔凈水洗手或不能使用洗手產品進行有效洗手而導致100萬人次的死亡[1]。使用香皂等洗手產品，可以將腹瀉的風險降低23%～48%，呼吸道感染的風險降低21%～23%[2-4]。因此，洗手特別是使用洗手產品進行正確的洗手，是預防疾病傳播的有效手段，對于控制傳染性疾病的傳播具有積極的意義。

當使用皂類等洗手產品時，產品中的表面活性劑會使皮膚脂肪乳化，并通過與微生物表面的親脂物質結合，形成乳化顆粒使其更容易從皮膚表面脫離，進而被水沖掉[5]。因此，使用洗手產品進行洗手，可以得到比機械搓洗更好的清潔效果[6]。但在目前，大多數對于手衛生依從性的教育和研究主要是在醫院和社區公共衛生系統進行的[7-8]，對于洗手產品的微生物作用的質量評價主要考慮其抗抑菌效果，而非綜合的清潔去除作用[9-10]。我國的標準體系中日化產品除菌的概念尚屬空白，現有的標準評價方法并不能很好地滿足企業和行業對于洗手產品質量控制和宣稱的需要。因此，建立一個安全可行的評價此類產品對細菌的去除效果的試驗方法，就顯得十分必要和迫切。

基于上述問題，本文以仿真皮為載體，驗證了仿真皮離體試驗與在體試驗的相關性，研究并建立了一個洗手產品除菌效果的體外評價方法并驗證了該方法的可重復性及適用性，為建立標準化的試驗方法提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 試驗菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)ATCC 6538、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，均購自廣東省微生物菌種保藏中心，本實驗室保存。

(2) 實驗載體：離體仿真皮(VITRO-SKIN，IMS)。

(3) 洗手產品：市售產品，分別編號為香皂，洗手液A～C。

1.2 主要儀器

生化培養箱(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)、拍打式均質器(Bag Mixer 400 mL，法國Inter science公司)、電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)、搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)、移液槍(Eppendorf)，其他小型設備及耗材均購自廣東環凱生物生物技術有限公司。

1.3 試劑與培養基

營養瓊脂培養基(NA)、營養肉湯培養基(NB)及SCDLP液體培養基均購自廣東環凱生物技術有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1體外洗手除菌測試流程

參照ASTM E1174—2013[11]、孫廷麗等體外除病毒的試驗方法[12]，并結合細菌的生物學培養特點，初步制定以下流程：

(1) 試驗用菌懸液的制備

取標準菌株在NA上劃線活化，于(36±1)℃，培養18 h～24 h。用接種環從平板上挑取一個單菌落接種到含有50 mL NB的錐形瓶中，培養18 h～24 h，得到最終濃度為108CFU/mL～109CFU/mL的菌懸液。

(2) 試驗載體的準備

無菌條件下打開仿真皮包裝，將仿真皮剪成6 cm×6 cm大小，糙面向上備用。每次試驗使用9片仿真皮，3片用于基線回收取樣(即接種后立即洗脫取樣)，3片用自來水清洗后作為對照組試樣；3片用作洗手產品洗手試樣。用水潤濕仿真皮表面，無菌紙巾輕拍干燥。

(3) 試驗菌的接種

取0.1 mL菌懸液接種于仿真皮表面，涂布棒擦拭至整個仿真皮表面，使仿真皮在空氣中自然干燥大約30 s。重復該過程3次。

(4) 基線菌落回收

接種完成后，取其中的3片仿真皮，進行基線回收。回收時，將仿真皮分別放入均質袋中，加入10 mL SCDLP，均勻揉搓仿真皮1 min，獲得洗脫液，并對洗脫液進行梯度稀釋計數。

(5) 體外洗手過程

調節水流速至約(4.0±0.3)L/min。洗手試驗用的水為市政自來水，其水質要求符合GB 5749的衛生要求。輕輕打濕染菌的仿真皮，然后按下列方式進行清洗：以自來水清洗作為對照試驗組,搓洗30 s，后流水沖洗30 s；對于固體類產品(如香皂)，使用產品擦15 s，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水沖洗30 s；對于液體類產品(如洗手液)，稱取0.45 g 樣品至皮表面，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水沖洗30 s；沖洗完畢，使用無菌紙巾輕輕拍干皮表面。將洗后的仿真皮分別進行菌落回收計數，回收方式同基線回收。

(6) 結果計算

以每次試驗時3片洗手產品洗手后取樣的離體仿真皮相對3片基線回收的仿真皮上菌落減少的對數平均值。

(7) 除菌有效性的確定

按相同測試條件進行2次測試，每次測試設置3個實驗重復，共6個重復。對6片對照組回收對數值與試驗組菌回收對數值進行t檢驗，顯著性水平取p≤0.05(雙尾檢驗)，評價測試樣品與對照樣品除菌性能是否存在差異。當兩組樣品結果存在顯著性差異，且對照組菌落對數值大于試驗組時，可認為試驗組樣品具有除菌功效。

1.4.2仿真皮與在體洗手試驗的相關性研究

制備2.0×108CFU/mL～2.0×109CFU/mL的菌懸液備用；樣品選用洗手液A、洗手液B和洗手液C。分別使用在體洗手方法及離體洗手流程進行洗手除菌試驗，并對結果進行統計學分析，驗證二者之間的相關性。

在體試驗采用《消毒技術規范》中消毒劑對手消毒模擬現場實驗的方法[13]。即將每個樣品分為2組，每組5人。首先使用液體肥皂洗手1 min去除手表面污染的自然菌，然后用無菌紗布將手擦干。將2×108CFU/mL～2×109CFU/mL菌懸液放入一無菌容器中，將手掌中間到指尖部位浸入菌懸液中，手指分開，停留5 s，將手離開菌懸液，在空氣中干燥3 min。干燥后立即將拇指與其他手指尖在含 10 mL TSB的平皿中搓洗1 min，取適當稀釋度接種平皿。計數菌落數，作為試驗前菌落數。不再重復污染手，立即進行試驗組處理。按說明書介紹的用量、作用時間和使用頻率以標準的洗手方法(搓擦30 s～60 s)。以流動的自來水沖洗5 s，抖掉手上殘留的水。立刻將拇指與其它手指尖在含10 mL中和劑的平皿中搓洗1 min，做適當稀釋后，分別取樣液1.0 mL以傾注法接種兩個無菌平皿，放37 ℃恒溫箱培養48 h，計數菌落數。離體試驗按1.4.1描述的洗手步驟進行試驗。試驗重復組數和試樣個數同在體試驗。

1.4.3方法的確認及驗證

需要確認的內容為使用洗手液、香皂對兩種細菌的去除率以及測試方法對不同產品劑型的適用性。另外，使用人員比對的方式驗證方法的可重復性。

1.4.4數據分析[14,15]

根據需要，將回收菌落數轉換為對數值。用x±s計算結果的指定值，采用變異系數(Coefficient of variation， CV)來考察數據的穩定性和可重復性；以|Z|值計算人員比對的有效性，使用SPSS計算方差齊性及t檢驗的p值。

2 結果

2.1 仿真皮與在體洗手試驗的相關性

3種洗手液分別進行在體洗手和離體洗手的除菌效果情況見表1。試驗結果顯示，在使用3種洗手液進行在體洗手時，兩種細菌減少的對數值均大于3，介于3.39～3.87之間，去除效果都比較理想，但是針對同一種微生物分別進行5組實驗人員結果的重復性分析，其變異系數(CV)相對比較大，最大的達到了13.59%，這說明試驗的結果受受試者個體差異影響比較大。在使用仿真皮作為試驗載體時，3種洗手液作用后，金黃色葡萄球菌的細菌平均減少對數值分別為3.47、3.61及3.82，大腸桿菌的細菌平均減少對數值分別為3.39、3.44及3.58，這些結果與在體模擬實驗的結果相近，人造皮與在體試驗的結果均沒有統計學差異(在體試驗及離體仿真皮試驗的同一種樣品、同一種微生物的洗去效果進行雙樣本等方差t檢驗，其P(0.05)均大于0.54)。綜上所述，仿真皮試驗結果與在體試驗結果具有一定的相關性，而且結果穩定性好，是一種理想的試驗載體。

表1 在體與離體洗手方法對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的去除效果比較

2.2 不同洗手產品的除菌效果試驗

使用市場上購買的不同的洗手產品(洗手液A～洗手液C，香皂)作為試樣，以金黃色葡萄球菌ATCC6538及大腸桿菌ATCC25922作為測試菌種，按離體除菌的試驗方法進行試驗，結果見表2。由表可知，金黃色葡萄球菌為試驗菌種時，洗手液A～洗手液C、香皂及清水進行洗手試驗時，載體上微生物的對數減少值分別為3.47、3.61、3.82、4.75及2.05，P(0.05)均<0.01，具有統計學意義；4種產品在5組試驗中的變異系數分別是7.41%、7.65%、6.25%及2.68%。使用大腸桿菌ATCC25922作為實驗菌種的的結果與金黃色葡萄球菌相似。采用洗手液A～洗手液C、香皂及清水進行洗手試驗時，載體上微生物的對數減少值分別為3.39、3.44、3.58、4.89及2.11，變異系數分別為6.28%、7.26%、4.60%及4.40%，與對照組的去除效果相比，其P(0.05)均<0.01。

表2 不同洗手產品的除菌效果試驗

為對產品的除菌有效性進行評價，選取了香皂產品進行了兩次重復試驗，共獲得6個平行數據，并對其進行了統計分析。結果見表3，當使用香皂進行洗手除大腸桿菌的試驗時，其基線恢復均大于107CFU/片，每片之間的偏差為0.08；對試驗組和對照組回收到的細菌的對數值進行F檢驗，其P0.05=0.37，P0.05>0.05，兩組試驗方差齊；對試驗組及對照組的回收對數值進行t檢驗，其P0.05<0.01，表明兩組之間具有統計學意義，說明測試的香皂相較僅使用清水進行洗手時，具有增加細菌去除的效果，計算獲得其除菌對數值為4.79。

表3 某香皂對大腸桿菌的去除效果

上述試驗結果表明，該方法適用于洗手液及香皂等不同劑型的產品的除菌效果的測試，并可以根據需要進行除菌效果的評價。使用統計學分析確定產品的除菌效果，并以除菌率來表征試驗結果，是科學可行的。同時由于其實驗重復較少，有效的降低了試驗成本及工作量，是一種比較合理的評價方式。

2.3 人員比對試驗

4位檢驗人員作為分別按照離體試驗方法對4個樣品及水樣樣進行了一次除大腸桿菌的檢測，結果見表4。對試驗結果進行計算分析，所有人的|Z|值均小于2。表明所有實驗人員的結果一致，沒有出現數據偏離，表明方法可重復性好。

表4 人員比對試驗結果

3 結論

本研究以離體仿真皮為試驗載體，進行了兩種常見劑型的洗手產品的除菌效果的測試，建立了一種安全、簡便、可操作性強的實驗流程。該方法與在體試驗相關性較好，以統計學方式對產品的除菌效果進行評價，減少了試驗可能引起的結果不穩定性的情況。同時，該方法能區分不同除菌能力的產品，適用于液體及固體兩種劑型，重復性及穩定性好，具有較好的應用價值，為進一步建立標準化的測試方法提供了數據支持，有助于填補我國日化產品除菌效果的性能評價的標準缺失的空白，促進行業的進步和發展。