用于米酒釀造的酵母菌的研究進展

王樂惠， 張繼寧， 周化嵐， 張建國

上海理工大學 健康科學與工程學院 食品科學與工程研究所，上海 200093

米酒作為我國傳統飲品，廣受消費者喜愛。米酒是以糯米、黑米、秈米等作為原料，通過浸泡、蒸煮、糖化、微生物發酵等多步驟工藝釀造制得(圖1)的傳統飲品。米酒的酒精含量也可高達20%v/v。米酒不僅酸甜可口，而且含有活性生物肽、氨基酸、有機酸、維生素、多酚類、酯類等多種有益健康的成分(表1)，具有增強食欲、免疫力、有效地改善消化腺分泌的功能[1]，以及降血壓及血脂[2]、舒緩疲勞、保護心臟的作用[3]。而且，王苗苗等還通過對羥自由基、氧自由基和DPPH自由基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)的抑制實驗報道了米酒的抗氧化性[4]。米酒釀造過程酵母菌對米酒品質有重要影響。而且我國各地米酒的種類繁多，米酒中酵母菌種類各異。因此研究米酒中酵母菌的種類和作用效果對調控米酒工藝，提升米酒品質具有重要意義。本文綜述了米酒中酵母菌，以及基于酵母菌的米酒品質和風味改善的應用。

表1 米酒中功能成分

圖1 傳統的米酒制備工藝示意圖

2 米酒中酵母菌分析技術及主要菌株

酵母菌分離、形態學分析、生化測試和分子生物學鑒定是確定酵母菌菌株的主要步驟。從米酒發酵過程中分離酵母菌是開展研究的重要步驟。由于酵母可以在組成廣泛的培養基上進行生長，因此從米酒發酵中分離酵母的培養基有麥芽提取物培養基、酵母培養基、葡萄糖-酵母提取物培養基等，并添加25 mg/L氯霉素[15]或土霉素(100 mg/L) 等抗生素篩選酵母菌。酵母菌通常在 pH 3.8～6.0 條件下生長，因此調整pH至更低值限制細菌生長[16]篩選酵母。添加聯苯(50 mg/L)、乙醇(12%)、亞硫酸鹽(0.015%) 選擇性有利于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生長[17]。

根據形態學描述、生理生化測試仍是目前常用的微生物鑒定技術[18]。酵母的主要特征為橢球狀或圓柱形細胞形狀，在極端環境下產生假菌絲和光滑細胞壁。例如酵母菌受到環境脅迫由球形轉變為短橢球狀子囊孢子。目前已有商業化的酵母鑒定試劑，如法國BioMérieux 公司的API 20C 和ID 32C試劑盒、美國Biolog Inc.公司的Biolog YT試劑盒等。近年來，隨著DNA測序技術的發展，隨機擴增多態DNA分析、脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)、指紋圖譜等新技術已經用于分析酵母菌。隨機擴增多態DNA方法利用隨機引物擴增DNA片段，再進行可視化分析。PFGE分析酵母菌株染色體組成，完成酵母菌種鑒定。指紋圖譜方法分析酵母基因組中隨機存在重復的微衛星序列，鑒別酵母菌株。例如，酵母基因組的delta序列的數目和位置常用于區分酵母菌株[19]。與PFGE方法相比，delta序列指紋圖譜在菌株水平的擴增模式具有偏好性。新型菌群分析技術，例如內源轉錄間隔區(Internally Transcribed Spacer，ITS)測序，還有待于應用于米酒釀造中酵母菌分析。ITS序列是位于真菌18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因之間，分別為ITS1和ITS2。由于ITS承受自然選擇壓力較小，表現出極為廣泛的序列多態性。并且ITS序列片段較小(ITS1和ITS 2長度分別為350 bp和400 bp)，易于分析，目前已被廣泛用于真菌不同種屬的系統發育分析。

表2總結了米酒中主要的酵母菌。雖然我國米酒產地的多樣性，酵母菌數有所不同，但是總體上主要為釀酒酵母菌。

表2 米酒中鑒定的酵母菌

3 酵母菌株改造技術

酵母菌株改造主要通過同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)兩種方式修復已斷裂酵母基因時插入，或者刪去一段基因來改變酵母基因組。圖2A為通過HR方式插入外源基因到酵母基因組的原理。外源基因通過兩端的同源臂與酵母基因組中相對應的片段發生同源雙交換，以“復制-粘貼”的方式安全(Generally recognized as safe，GRAS)且精確地插入到酵母基因組中。CRISPR/Cas (有規律間隔的聚類短回文重復及相關蛋白) 系統是一種全新的基因編輯技術，在2013年首次應用于釀酒酵母[31]。圖2B為CRISPR/Cas系統用于酵母基因改造的原理。內切酶Cas被一小段RNA引導到匹配的基因序列后完成切割，產生雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)[32-33]。酵母通過HR或NHEJ 途徑修復時完成基因片段的插入或敲除。NHEJ方式在沒有模板的情況下將雙鏈斷裂的酵母基因組連接起來，故NHEJ較易產生錯誤。HR和CRISPR在基因改造的精確性、無縫和無標記特點方面具有相互補充的作用。

(A: 同源重組；B: CRISPR技術)

雙鏈斷裂是酵母細胞交換基因所必需的步驟[34]。例如釀酒酵母的一種內切酶(HO-內切酶)能特異性切割基因組中交配型位點(Mating-type, MAT)，產生雙鏈斷裂[35]。缺失HO基因的酵母細胞的傳代穩定，不易發生基因交換。這表明DNA雙鏈斷裂是配合型細胞的基因交換過程所必需的步驟。缺失HO基因的酵母突變體可作為穩定的單倍體菌株被用于基因改造。而且，釀酒酵母進行HR的同源臂可短至35 bp[36]。在釀酒酵母中重組表達HR的關鍵酶Rad51、Rad52顯著提高HR效率[37-38]。相比用限制性內切酶進行克隆引入多余堿基的缺點，HR無需引入外來的限制性內切酶位點，實現無縫連接。HR可將25個長17 kb到26 kb的DNA片段在釀酒酵母中組裝成支原體基因組[39-40]。該技術還被用于組裝全合成的釀酒酵母基因組(酵母2.0)[41]。

為了避免在基因改造過程中使用抗性標記基因，研究人員開發了以URA3基因為篩選標記的重組酶誘導系統。基于URA3編碼的蛋白質具有抗5′-氟乳酸功能，重組酶誘導系統通過基因重組或丟失質粒的方式，實現不采用抗性標記基因的方式[42]篩選突變菌株[43]。另外一種方法為基于噬菌體p1特異性的Cre-loxP重組系統。LoxP是一段Cre重組酶識別的34 bp序列[44]。Cre-loxP重組系統中在標記基因兩側分別整合loxP位點，完成重組后，Cre重組酶在酵母中表達并切割loxP位點，刪除標記基因[45]。

4 基于酵母菌提升米酒釀造的進展

酵母菌在米酒釀造過程中不僅有生產乙醇的作用，還與其它微生物共同作用，對改進米酒釀造工藝、提高米酒品質有重要作用。

4.1 改進米酒釀造工藝

基于酵母菌株改進米酒釀造工藝的研究主要為兩個方面。第一方面為采用外加酵母菌株改進釀造工藝。例如，楊建忠等利用干酵母延長黑米酒生產期，提高了出酒率，降低了發酵酸度，增強發酵力，防止雜菌感染，具有很好的經濟效益和社會效益[46]。馬玉麟采用耐高溫活性干酵母改進豉香型米酒釀造工藝，豉香型米酒獲得了國優等多個獎項[47]。第二個方面為多種微生物復配，改進米酒釀造工藝。顏兵優化了釀酒酵母和異常漢遜酵母的復配比例為100∶1時，乙酸乙酯含量提高了6.1倍；進一步優化得到以上2種酵母的最優釀造條件為31.2 ℃、發酵時間10.7 d、料液比80%(v/v)時，具有較高出酒率[48]。除酵母外，米酒中常見的微生物為霉菌，因此，目前與酵母復配的微生物主要為霉菌。例如，袁華偉等將釀酒酵母與米曲霉復配后，優化了酵母接種量、發酵溫度、發酵時間，結果表明酵母接種量1.0%(以原料大米計)、25 ℃的13 d兩步法發酵工藝顯著提升了米酒的產率和質量[49]。盧福芝等將酵母菌與毛霉和酵母復配后發酵，得到最高乙醇產量為207 g/L，不僅釀造工藝更簡單，而且米酒成分更豐富地包括醇、醛、酸及酯[26]。

4.2 提高米酒風味

酵母提高米酒風味的研究主要集中在米酒風味的判斷和香味成分的鑒定。例如，袁華偉等將釀酒酵母和米曲霉進行復合后釀酒的米酒的乙醇含量為13.2%(v/v)。米酒呈現米黃色，具有水果香和花香，且感官評分為87.1分[49]。伍國明等利用酵母菌發酵郁南無核黃皮果和糯米，得到橙黃色、醇厚、甘甜爽口有獨特風味的米酒[50]。王奇盛等優化了異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、扣囊復膜酵母(Saccharomycesfibuligera)和釀酒酵母三種酵母復配比例后，釀造米酒中高級醇含量下降了7.2%，米酒感官評分高達90.1分[51]。王奇盛等測定了上述三種酵母發酵米酒的風味物質，結果表明有機酸含量降低，酯類和醛類物質增加，感官評定表明米酒的口感與香氣有著明顯的提升[52]。鄭瑞龍等篩選到1株具有優良香氣特征的釀酒酵母NO.26。使用該菌株發酵米酒的香味物質含有苯乙醇(玫瑰、花香)、芳樟醇(薰衣草、花香)、十六酸乙酯(果香、奶油香)等揮發性風味化合物[53]。李澤洋等利用扣囊復膜酵母 11Z1發酵的米酒中包含醇類5種、酯類3種、酸類5種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種和其他類4種，共計21種風味物質。其中，乙酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯的量分別提高了1.6、2.2和1.4倍[24]。車逸心等復配紅曲菌和酵母后釀造的米酒中含有47種揮發性組分(6種醇類、14種酸類、12種酯類、8種醚類、4種醛酮類、2種醌類和1種酚類)[54]。由于用于米酒釀造的菌株、原料、工藝條件的不同，形成米酒風味的物質種類和含量都有顯著差異。

5 展望

多種米酒的酵母菌已經被分離鑒定，而且也基于酵母改進了米酒釀造工藝，提升了米酒風味，說明酵母菌在米酒釀造的重要作用已經體現。但是，對米酒中酵母菌的研究仍有較大空間，主要體現在2個方面。首先，ITS測序等新型菌群分析技術應更廣泛用于米酒釀造中酵母菌的鑒定。基于原位取樣的ITS測序避免了培養酵母過程中菌株種類的改變，有利于發現更多的酵母菌種。其次，加強合成生物學技術的運用。目前酵母分子生物學技術不僅僅可以利用啟動子工程、拷貝數、輔因子調節蛋白的改造，還可以進行組合途徑的優化，代謝途徑動態調控、合成基因組等工作，提升米酒的釀造工藝和品質。