牛蒡子苷元對彈性蛋白酶的抑制作用研究

付金鳳，姚紅柳，李美霖，尹廣婷，趙彬旭，崔晉瑋，蘇麗紅

(1.長春師范大學，吉林 長春130032；2.中國醫科大學，遼寧 沈陽 110122)

彈性蛋白酶(PPE)是一種蛋白水解酶，可以水解彈性蛋白、血漿蛋白等，是肺部重要組成部分[1]，還可以誘導上皮細胞釋放炎癥因子，與肺組織損傷關系密切，其過度表達會引發急性肺損傷、呼吸窘迫綜合征等炎癥性疾病[2]。彈性蛋白酶已成為抗炎藥物篩選的較佳酶靶[3]。

牛蒡子苷元(Arc)是一種苯丙素二苯基丁內酯木脂素[4]，結構如圖1，具有抗炎[5]、抗病毒等藥理作用[6]。SHI等[7]發現牛蒡子苷元可減輕由脂多糖(LPS)引起的急性肺損傷；ZHANG等[8]發現牛蒡子苷元(50 mg/kg)可顯著抑制LPS引起的肺組織炎癥反應。對比幾種天然二苯基丁內酯類木脂素對彈性蛋白酶的抑制作用[9]，選取活性最好的牛蒡子苷元進一步研究。

圖1 牛蒡子苷元結構

為新型彈性蛋白酶抑制劑的研究提供參考，本文以牛蒡子苷元作為研究對象，通過酶靶活性篩選模型，運用酶促反應動力學研究牛蒡子苷元對彈性蛋白酶的抑制作用，包括半數抑制濃度(IC50)、抑制常數(Ki)以及抑制類型；通過紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜、紅外光譜研究了Arc對PPE構象的影響；通過分子對接模擬Arc與PPE的相互作用，分析了其作用力類型以及作用位點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛蒡子苷元；Tris-HCl緩沖液；彈性蛋白酶(PPE,EC3.4.21.36)(Sigma公司)；N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA(Sigma公司)。

多功能讀板機 FlexStation3(MolecularDevices公司)；96孔聚苯乙烯透明平底微孔板(COSTAR公司)；Cary 300紫外可見分光光度計(美國Agilent Technologies公司)；MOS-500圓二色譜儀(法國Biologic)；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 IC50值測定

彈性蛋白酶、底物、抑制劑均用Tris-HCl緩沖液配制。測定時在96孔板反應，每孔中加入1 mmol/L的底物30 μL，1 μmol/L的彈性蛋白酶溶液30 μL，2 mmol/L的牛蒡子苷元溶液分別加0、20、40、50、60、80、100、120、140 μL，用緩沖液補充總體積為200 μL，以緩沖溶液為空白，用酶標儀于波長405 nm計時測定303 K溫度下反應的吸收值，并計算其抑制率。做三次平行實驗。

1.2.2 抑制常數Ki

測定時在96孔板反應，每孔中加入1 μmol/L的彈性蛋白酶溶液30 μL，與0、50、100、140 μL的2 mmol/L牛蒡子苷元溶液，以及濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.80、1.00 mmol/L的30 μL底物反應，用緩沖液補充總體積為200 μL，以緩沖溶液為空白，用酶標儀于波長405 nm計時測定303 K溫度下的酶解反應速率。重復三次平行實驗。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜

分別配制5×10-6mol/L PPE、2×10-5mol/L Arc、5×10-6～2×10-5mol/L Arc-PPE溶液，搖勻，室溫下靜置5 min。選1 cm吸收池，量取3 mL待測液體，用Tris-HCl緩沖溶液作空白參比，掃描并記錄200～500 nm范圍的紫外可見吸收光譜。

1.2.4 圓二色光譜

用PBS分別配置5×10-6mol/L的PPE、5×10-6～1×10-5mol/L的Arc-PPE溶液待測。選用1 mm的石英吸收池，移取300 μL待測液體掃描波長范圍設置為190～250 nm，狹縫寬度設置為2 nm，時間為1 s，以PBS緩沖溶液為背景，做三組平行實驗。

1.2.5 紅外光譜

采用壓片法，掃描PPE、Arc-PPE在400～4 000 cm-1波數范圍的紅外光譜。

1.2.6 分子對接模擬

通過Schrodinger軟件中的“Protein Preparation Wizard”程序對蛋白進行加氫以及對蛋白晶體結構中非完整氨基酸殘基進行矯正，同時在Chem Bio 3D Ultra 14.0軟件中對PPE及Arc三維結構進行能量最優化。最后使用Auto Dock 4.2.6軟件進行分子對接。

2 結果與討論

2.1 半數抑制濃度IC50值

半數抑制濃度(IC50)可以體現牛蒡子苷元對彈性蛋白酶的抑制作用，IC50即當對彈性蛋白酶的抑制率為50%時牛蒡苷元的濃度。以牛蒡子苷元的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制曲線，結果見圖2。抑制率隨著牛蒡子苷元濃度的增加而增加，趨勢先陡后趨于平緩，抑制率達到50%時牛蒡子苷元濃度為1.25 mmol/L，即IC50=1.25 mmol/L。

圖2 牛蒡苷元對彈性蛋白酶的百分抑制率

2.2 抑制常數Ki

圖3 Lineweaver-Burk曲線圖

計算得抑制常數Ki= 6.19×10-4mol/L。

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

PPE的紫外吸收光譜中280 nm附近的吸收峰是由Tyr殘基中共軛雙鍵及Trp殘基的吲哚環所貢獻，但由于Trp的紫外吸收遠遠大于Tyr，所以主要是Trp的貢獻[12]。圖4為PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光譜，且APPE+AArc≠AArc-PPE。PPE在280 nm附近出現的吸收峰在加入Arc后發生紅移，表明Arc與彈性蛋白酶結合改變了構象。

(a)PPE；(b)Arc；(c)Arc-PPE圖4 PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光譜圖

2.4 圓二色光譜分析

圓二色光譜在遠紫外區(185～245 nm)的特征峰可以判定蛋白質多肽主鏈構象變化，研究生色團的微環境[13]。圖5分別表示PPE、PPE-Arc的圓二色光譜圖，從圖中可以看出，牛蒡子苷元加入使208 nm、200 nm附近的負帶增加，說明α-螺旋結構所占比例增加，通過圓二色光譜儀所帶計算軟件Dicroport計算，彈性蛋白酶中α-螺旋結構由6.909%增加至7.864%。牛蒡子苷元的加入使彈性蛋白酶的二級構象發生了變化。

(a)PPE；(b)Arc-PPE圖5 PPE、Arc-PPE圓二色光譜

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

(a)PPE；(b)Arc-PPE圖6 PPE和Arc-PPE的紅外光譜

2.6 分子對接模擬

分子對接模擬結果如圖7所示，軟件計算最佳結合能為-30.932 kJ/mol。牛蒡子苷元具有二芐基丁內酯結構，其中五元內酯的羰基氧與彈性蛋白酶中纈氨酸(VAL99)產生了氫鍵作用力；苯環上甲氧基與蘇氨酸(THR175)產生了氫鍵作用力，苯環與精氨酸(ARG217A)產生了π-陽離子作用，并且與亮氨酸(LEU218)、賴氨酸(LYS224)、絲氨酸(SER217)、纈氨酸(VAL216)(VAL99)、精氨酸(ARG217A)、苯丙氨酸(PHE215)、組氨酸(HIS57)、色氨酸(TRP1729)、天冬氨酸(ASP97)有范德華作用；與蘇氨酸(THR175)(THR96)、丙氨酸(ALA99)有靜電作用；與精氨酸(ARG217A)、蘇氨酸(THR175A)、纈氨酸(VAL99)、色氨酸(TRP172)有疏水作用。牛蒡子苷元的二芐基丁內酯結構可以與彈性蛋白酶以π-陽離子作用、氫鍵作用、范德華作用、疏水作用以及靜電作用緊密結合。

圖7 Arc-PPE分子對接模擬

3 結論

以上研究表明，牛蒡子苷元對彈性蛋白酶有抑制作用，其抑制類型為競爭性抑制，半數抑制濃度IC50= 1.25 mmol/L，抑制常數Ki= 6.19×10-4mol/L，與目前臨床上使用的彈性蛋白酶抑制劑——西維來司鈉(Ki=2×10-4mol/L)的Ki在同一個數量級。紅外光譜、紫外光譜均表明，牛蒡子苷元與彈性蛋白酶產生了相互作用，并改變了彈性蛋白酶二級結構。圓二色光譜表明牛蒡子苷元使彈性蛋白酶中α-螺旋所占比例增加，無規則卷曲所占比例增加。結合分子對接結果，牛蒡子苷元與彈性蛋白酶作用存在π-陽離子、氫鍵作用、范德華作用、疏水作用以及靜電作用等多種作用力，兩者可以較好地結合，干擾了彈性蛋白酶對底物的分解，從而降低酶的活性。二苯基丁內酯結構中五元內酯的羰基氧結構、苯環及甲氧基結構均是很好的作用位點。以上研究可以為新的彈性蛋白酶抑制劑的設計、合成提供新的思路。