視網膜內質網應激免疫組織化學抗體濃度選擇的實驗研究

陳小紅，梁婉嬌，黃詩舒，孫 晏，羅 欣，賴 璐，池昭晟，陳梅珠，王云鵬，嚴偉明

0 引言

應用已知抗體和抗原發生特異性結合，并通過化學反應使標記在結合后的特異性抗體上的顯色劑(如熒光素、酶、金屬離子和核素)顯色，以確定組織細胞內抗原的存在，對其進行定位、定性及半定量研究，稱為免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)[1]。目前廣泛應用于腫瘤疾病、感染疾病及藥物靶向治療等方面[2]。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應主要包括三種通路，即肌醇需要酶1(inositol-requiring protein-1，IRE1)通路、轉錄激活因子6(activating transcription factor-6，ATF6)通路、蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-related ER kinase，PERK)通路。當發生ERS時，其上、下游多種相關信號分子亦發生相應的改變，本研究選用葡萄糖調劑蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase-12)作為反應ERS的上、下游分子的檢測指標。

近年研究發現，多種視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)模型中內質網有異常蛋白堆積，有相應ERS反應發生[3-5]；目前在RP動物模型的構建中，N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導的RP模型已被廣泛報道[6-8]。IHC亦應用于ERS通道研究[9-13]，但其在ERS通道相關抗體使用濃度缺乏統一標準，且因實驗標本不同，根據抗體說明書建議稀釋比例進行IHC，其結果可能過強或較弱。因此，本研究選用MNU誘導的小鼠RP模型，應用IHC技術檢測其視網膜ERS反應通路，探討IRE1、ATF6、PERK、GRP78、Caspase-12抗體的最佳使用濃度，以期為研究RP發病機制及干預措施提供相應指標的檢測方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級、健康雄性C57BL/6J小鼠[上海昇敞生物科技有限公司，SCXK(滬)2021-0002]，6～8周齡，體質量16～20g。于室溫22℃～25℃、明暗交替12h/12h的環境中適應性飼養14d，食水不限。實驗動物的使用遵循視覺與眼科研究協會(Association for Research in Vision and Ophthalmology，ARVO)相關規定，并通過倫理審查(2021-001)。

1.1.2主要試劑與器材戊巴比妥鈉溶液(上海行知化工廠，1%體積質量比)；鹽酸賽拉嗪注射液[商品名：陸眠寧，吉林省華牧動物保健品有限公司；規格：2mL∶0.2g；批號：獸藥字(2015)070011777]；N-甲基-N-亞硝基脲(MNU，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N136701-1g)，4℃環境儲存于惰性氣體中，使用前立即溶解于含0.05%醋酸的鹽水中；粉劑型抗原修復液(檸檬酸法)(福州邁新生物技術開發有限公司，MVS-0066)；抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9030)；小鼠二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-9002)；兔二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，PV-9001)；Anti-IRE1抗體(美國abcam，ab37073)；Anti-ATF6抗體(美國abcam，ab203119)；PERK抗體(B-5)(美國santa cruz，sc-377400)；BiP(C50B12) Rabbit mAb(GRP78)(美國Cell Signaling Technology，3177S)；Caspase-12抗體(1611)(美國santa cruz，sc-21747)。電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，SECURA124-1CN)；組織包埋機(LEICA，EG1150)；自動脫水機(LEICA，ASP300S)；石蠟切片機(LEICA，RM2245)；隔水式恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司，GHP-9080)；光學顯微鏡(OLYMPUS，BX53)。

1.2方法

1.2.1動物造模取8只C57BL/6J小鼠，采用隨機分組法分為正常組(N)和造模組(M)，每組4只，分別腹腔注射生理鹽水和60mg/kg MNU[14]，造模后第7d時分別對小鼠進行視網膜電圖(electroretinogram，ERG)檢測及摘取小鼠眼球行蘇木精-伊紅(HE)染色組織切片，以觀察到ERG呈熄滅型、HE染色組織切片上視網膜外核層感光細胞消失為小鼠RP模型造模成功。

1.2.2ERG檢測完全暗適應2h以上，采用戊巴比妥鈉(0.3mL/100g)和鹽酸賽拉嗪注射液(0.01mL)聯合腹腔注射麻醉小鼠，復方托吡卡胺滴眼液點眼散瞳，安裝電極(記錄電極置于小鼠右眼角膜中央，參考電極置于小鼠同側頰部，接地電極插于小鼠尾部皮下)。固定小鼠于Ganzfeld刺激器前,運用RETI-SCAN視覺電生理檢查系統(德國Roland Consult公司)進行國際臨床視覺電生理學會(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV)ERG五項檢測，包括暗適應0.01反應、暗適應3.0反應、暗適應Ops波反應、明適應3.0反應、明適應Flicker反應(明適應反應檢測前進行10min標準光強明適應)[15]。

1.2.3組織切片制作ERG檢查結束后，注射大劑量戊巴比妥鈉溶液使小鼠死亡，立即摘取右側眼球，置于混合固定液(冰乙酸、甲醛、生理鹽水、75%乙醇按1∶2∶7∶10比例配制)中2h后，用注射器在眼球角膜中央扎一小孔，放回固定液中繼續固定24h[16]。將固定24h后的眼球置于自動脫水機中，經梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟后制成石蠟標本。在組織包埋機上，按瞳孔-晶狀體-視神經軸方向固定眼球，進行包埋，待石蠟凝聚成塊后，在旋轉石蠟切片機上，每個眼球沿瞳孔-視神經軸方向切片，取經視神經連續6張切片，厚度為4μm，攤片、撈片。

1.2.4HE染色組織切片在烤片機上70℃烤片20min，脫蠟至水、HE染色后樹脂封片。光學顯微鏡下觀察小鼠眼球組織切片結構。

1.2.5IHC染色將恒溫水箱70℃烤片1h的切片經脫蠟、復水、抗原修復后，3% H2O2中室溫封閉10min，PBS沖洗后，滴加一抗(陰性對照用PBS代替一抗，根據說明書及目前相關研究報道，按以下濃度稀釋抗體：IRE1 1∶125、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000；ATF6 1∶100[17]、1∶250、1∶500、1∶1000[18]、1∶2000；PERK 1∶100[19-20]、1∶500、1∶1000、1∶1500；GRP78 1∶100[21-22]、1∶200[23-24]、1∶500[25]；Caspase-12 1∶100[26]、1∶500、1∶1000)，37℃孵育1h；PBS沖洗后，37℃環境先后滴加增強劑、二抗，各孵育20min；DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，乙醇脫水透明封片。光學顯微鏡下觀察，并于視乳頭旁500μm處拍攝高倍鏡(40×10)視野照片，通過圖像分析軟件Image J對視網膜內質網應激蛋白染色陽性信號進行定量分析。

2 結果

2.1RP小鼠模型造模情況腹腔注射給藥后第7d時，正常組小鼠視網膜各層組織結構排列整齊，未見明顯變化，ERG暗、明適應3.0反應均可見b波；而造模組小鼠視網膜外核層細胞基本消失，且ERG暗、明適應3.0反應的b波均消失，ERG波形大致呈熄滅型，表明小鼠RP模型建立成功(圖1)。

圖1 正常組和造模組小鼠視網膜形態與功能檢測結果 A：HE染色顯示正常組小鼠視網膜各層形態結構正常(綠色箭頭示視網膜外核層)；B：HE染色顯示造模組小鼠視網膜外核層細胞凋亡(紅色箭頭示視網膜外核層)；C：正常組小鼠造模后第7d ERG暗、明適應3.0反應均可見b波振幅的代表性波形(綠色箭頭示b波位置)；D：造模組小鼠造模后第7d ERG暗、明適應3.0反應均可見b波振幅消失的代表性波形(紅色箭頭示b波位置)。RPE：視網膜色素上皮層；OS：外節；IS：內節；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內核層；IPL：內叢狀層；GCL：神經節細胞層。

2.2RP小鼠視網膜ERS相關蛋白IHC染色

2.2.1RP小鼠視網膜IRE1蛋白IHC染色結果IHC染色結果顯示，IRE1抗體濃度為1∶125、1∶250、1∶500時，全視網膜(包括細胞核、細胞漿)均呈棕色；IRE1抗體濃度為1∶1000、1∶2000時，視網膜神經節細胞層中神經節細胞呈陽性表達，內核層部分細胞呈陽性表達，外核層細胞呈繞核陽性表達，其余視網膜結構層均呈淡棕色，見圖2A。

圖2 RP小鼠視網膜不同濃度IRE1抗體IHC染色結果 A：IRE1不同抗體濃度IHC染色典型圖，A1：1∶125；A2：1∶250；A3：1∶500；A4：1∶1000；A5：1∶2000；A6：陰性對照。B：定量分析各抗體濃度IHC染色陽性表達結果，bP<0.01 vs IRE1抗體濃度1∶125；dP<0.01 vs IRE1抗體濃度1∶250；fP<0.01 vs IRE1抗體濃度1∶500；hP<0.01 vs IRE1抗體濃度1∶1000。

IRE1抗體濃度為1∶125、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000時，RP小鼠視網膜IRE1陽性表達分別為(32.93±3.44)%、(34.33±2.59)%、(33.56±2.63)%、(29.89±2.77)%、(21.90±2.39)%，差異有統計學意義(F=54.996，P<0.001)，其中除IRE1抗體濃度為1∶125、1∶250、1∶500時，IRE1蛋白陽性表達兩兩比較差異無統計學意義(均P>0.05)，其余抗體濃度IRE1蛋白陽性表達兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2B。

2.2.2RP小鼠視網膜ATF6蛋白IHC染色結果IHC染色結果顯示，視網膜內節層至神經節細胞層均可見陽性表達，其中神經節細胞層、內核層、外核層為核周表達，神經節細胞層、內核層中少數細胞呈陽性表達，且表達強度隨ATF6抗體稀釋倍數增加而減弱，見圖3A。ATF6抗體濃度為1∶100、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000時，RP小鼠視網膜ATF6蛋白陽性表達分別為(33.47±2.96)%、(32.48±1.30)%、(25.27±1.07)%、(25.42±2.14)%、(13.02±1.98)%，差異有統計學意義(F=348.948，P<0.001)，其中除ATF6抗體濃度為1∶100、1∶250時和ATF6抗體濃度為1∶500、1∶1000時，ATF6蛋白陽性表達差異均無統計學意義(P>0.05)，其余抗體濃度ATF6蛋白陽性表達兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖3B。

圖3 RP小鼠視網膜不同濃度ATF6抗體IHC染色結果 A：ATF6不同抗體濃度IHC染色典型圖，A1：1∶100；A2：1∶250；A3：1∶500；A4：1∶1000；A5：1∶2000。B：定量分析各抗體濃度IHC染色陽性表達結果，bP<0.01 vs ATF6抗體濃度1∶100；dP<0.01 vs ATF6抗體濃度1∶250；fP<0.01 vs ATF6抗體濃度1∶500；hP<0.01 vs ATF6抗體濃度1∶1000。

2.2.3RP小鼠視網膜PERK蛋白IHC染色結果IHC染色結果顯示，PERK抗體濃度為1∶100時，全視網膜呈強陽性表達，PERK抗體濃度為1∶500、1∶1000、1∶1500時，除神經節細胞層、內核層及外核層的細胞核外，其余視網膜結構均呈陽性表達，見圖4A。PERK抗體濃度為1∶100、1∶500、1∶1000、1∶1500時，PERK蛋白陽性表達分別為(68.03±6.84)%、(38.51±3.91)%、(39.18±5.78)%、(31.90±5.76)%，差異有統計學意義(F=153.712，P<0.001)，其中除PERK抗體濃度為1∶500、1∶1000時，PERK蛋白陽性表達差異無統計學意義(P>0.05)，其余抗體濃度PERK蛋白陽性表達兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖4B。

圖4 RP小鼠視網膜不同濃度PERK抗體IHC染色結果 A：PERK不同抗體濃度IHC染色典型圖，A1：1∶100；A2：1∶500；A3：1∶1000；A4：1∶1500。B：定量分析各抗體濃度IHC染色陽性表達結果，bP<0.01 vs PERK抗體濃度1∶100；dP<0.01 vs PERK抗體濃度1∶500；fP<0.01 vs PERK抗體濃度1∶1000。

2.2.4RP小鼠視網膜GRP78蛋白IHC染色結果IHC染色結果顯示，視網膜神經節細胞層、內核層表現為繞核陽性表達，其中神經節細胞層少數細胞呈陽性反應，內核層及外核層個別細胞呈陽性反應，且隨抗體稀釋倍數增加陽性表達減弱，見圖5A。GRP78抗體濃度為1∶100、1∶200、1∶500時，RP小鼠視網膜GRP78蛋白陽性表達分別為(15.32±3.57)%、(12.75±2.35)%、(10.75±2.78)%，差異有統計學意義(F=12.740，P<0.001)，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5B。

圖5 RP小鼠視網膜不同濃度GRP78抗體IHC染色結果 A：GRP78不同抗體濃度IHC染色典型圖，A1：1∶100；A2：1∶200；A3：1∶500。B：定量分析各抗體濃度IHC染色陽性表達結果，bP<0.01 vs GRP78抗體濃度1∶100；cP<0.05 vs GRP78抗體濃度1∶200。

2.2.5RP小鼠視網膜Caspase-12蛋白IHC染色結果IHC染色結果顯示，除視網膜神經節細胞層、內核層及外核層細胞核外，其余視網膜結構均呈陽性表達，見圖6A。Caspase-12抗體濃度為1∶100、1∶500、1∶1000時，RP小鼠視網膜Caspase-12蛋白陽性表達分別為(24.24±4.30)%、(14.26±2.21)%、(12.26±1.46)%，差異有統計學意義(F=96.978，P<0.001)，且兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6B。

圖6 RP小鼠視網膜不同濃度Caspase-12抗體IHC染色結果 A：Caspase-12不同抗體濃度IHC染色典型圖，A1：1∶100；A2：1∶500；A3：1∶1000。B：定量分析各抗體濃度IHC染色陽性表達結果，bP<0.01 vs Caspase-12抗體濃度1∶100；dP<0.01 vs Caspase-12抗體濃度1∶500。

3 討論

IHC染色通過已知一抗及相應二抗與特定目標分子反應，再通過酶標抗體染色法，使目標分子在普通顯微鏡下即可直接觀察其分布情況。目前RP相關研究中，常使用免疫熒光染色技術(IF)進行亞細胞器定位；然而IF染色信號需通過熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡顯現，技術要求相對較高[27]。內質網是細胞內細胞器的一種，負責細胞內多種蛋白的折疊、加工。ERS是由于正常內質網的內環境受到多種因素刺激后導致蛋白折疊異常、堆積，最終引起細胞功能紊亂，甚至引起細胞凋亡，造成相應疾病的產生，其中包括RP。運用IHC技術檢測ERS通道相關蛋白，包括ATF6、PERK、IRE1、GRP78、Caspase-12，根據其陽性反應強度變化，可大致判斷ERS三條通路在RP中的參與程度，探索其發病機制，具有簡單可行性。

然而，目前關于應用IHC研究ERS相關蛋白的抗體濃度及染色方法未見詳細統一報道。Crespo等[28]于2012年探索谷氨酰胺對實驗性炎性腸病大鼠ERS和細胞凋亡的影響，對結腸標本行IHC染色時，使GRP78抗體與標本4℃孵育過夜，未明確提及抗體稀釋比例。Liu等[29]在2015年研究氟中毒成骨細胞ERS反應時，應用IHC檢測氟暴露Wistar大鼠骨組織，其中GRP78、Caspase-12抗體稀釋比例為1∶100。2016年，Guo等[23]研究ERS是否參與鎳腎毒性機制時，應用稀釋比例為1∶200的GRP78抗體與氯化鎳(NiCl2)激活的肉仔雞腎臟組織在4℃孵育過夜。Hirai等[30]于2018年研究ER在麻風病發病機制中的意義，對麻風病患者標本進行IHC檢測，其中GRP78、PERK、IRE1α和ATF6抗體按1∶100比例稀釋，孵育時間為14h。2020年，Samanta等[31]研究ERS與卵巢癌的相關性時，采用IHC染色檢測患者標本時，GRP78、PERK、ATF6抗體孵育30～60min，未明確提及稀釋比例。

不同疾病模型中，ERS反應參與程度不同，且實驗組織標本各異，因此若簡單根據抗體說明書提供的IHC抗體稀釋比例及抗體孵育時間或不同疾病、組織的相關研究數據進行實驗，最終IHC染色結果差異較大，未能達到實驗者所需的最適陽性表達。目前尚無IHC應用于視網膜ERS反應相關指標的詳細研究報道，而本研究前期預實驗發現ATF6、PERK抗體單純根據說明書建議的稀釋比例進行IHC染色，均未能得到較滿意的IHC染色結果。因此，本研究針對RP小鼠模型，將ERS通路中的相關抗體根據說明書及在現有相關研究的基礎上，各設置3個及以上稀釋濃度，孵育時間均為1h，以便后期根據其陽性表達程度，選擇合適的抗體濃度檢測相應指標。結果發現，IRE1、ATF6、PERK、GRP78、Caspase-12不同抗體濃度均可在視網膜呈陽性表達，但其強弱程度不同。IRE1抗體濃度為1∶125、1∶250、1∶500時IRE1蛋白陽性表達無區別，且均呈強陽性，IRE1抗體濃度為1∶1000時陽性表達較適宜，IRE1抗體濃度1∶2000時內核層陽性表達明顯減弱，這與麻風病組織IHC染色時所使用的1∶100 IRE1抗體孵育14h具有明顯差異[30]。ATF6抗體濃度為1∶100和1∶250時其蛋白陽性表達在視網膜各層結構均較強、無法區別，ATF6抗體濃度為1∶500和1∶1000時ATF6蛋白陽性表達適宜，ATF6抗體濃度為1∶2000時其陽性表達在神經節細胞層、內核層、外核層均不顯著，而麻風病組織IHC染色時采用1∶100 ATF6抗體孵育14h[30]，卵巢癌組織ATF6抗體(未說明抗體濃度)IHC染色一抗孵育時間為30～60min[31]，均與本研究不同。PERK抗體各濃度陽性表達均較強，PERK抗體濃度為1∶1500時其目標蛋白陽性表達仍較適宜，本研究中1∶1500的PERK抗體稀釋比例遠遠低于麻風病組織所使用的1∶100 PERK抗體稀釋濃度，且孵育時間明顯縮短[30]。GRP78抗體濃度為1∶200時，其在RP小鼠視網膜神經節細胞層中與內核層中繞核陽性表達清晰、強度適宜，目前已有的相關研究中，GRP78較常用的稀釋比例為1∶100[28，31]，亦可見1∶200的抗體稀釋比例[23]，但其一抗孵育時間均遠大于本研究抗體孵育時間。Caspase-12抗體濃度為1∶100時，在視網膜陽性表達較強，Caspase-12抗體濃度為1∶500、1∶1000時，Caspase-12蛋白陽性表達不明顯，這與氟中毒成骨細胞ERS反應的相關研究所使用的抗體濃度相符[29]。

本研究結果表明，小鼠RP模型視網膜ERS通路相關抗體IRE1抗體濃度為1∶1000、ATF6抗體濃度為1∶500和1∶1000、PERK抗體濃度為1∶1500、GRP78抗體濃度為1∶200、Caspase-12抗體濃度為1∶100，一抗孵育時間為1h時，均可獲得陽性表達強度較適宜的IHC檢測結果，可在一定范圍內作為后續研究RP中ERS發病機制及干預措施療效提供具體指標檢測參考。未來將在本研究基礎上擴大實驗動物數量、進一步探索MNU誘導的RP小鼠發病過程中視網膜ERS反應通路中各通路參與其發病機制的情況。