鐵死亡機制在視網膜色素上皮細胞損傷相關眼病中的研究進展

王巧云，解來青

0 引言

鐵是人體生命活動過程中必不可少的成分，它對視網膜中的視覺光導級聯至關重要。然而，過量的鐵是有害的，鐵的積累易使老化的視網膜細胞發生氧化應激，從而誘導細胞死亡，即鐵死亡(ferroptosis)。鐵死亡是一種新近發現的由脂質過氧化引起、以鐵依賴性積累為特征的程序性細胞死亡[1]。視網膜光感受器(photoreceptor, PR)是高度專一的感覺神經元，可通過其細胞外節感知光信號，具有獨特的代謝和生理功能，是視覺光導級聯的重要組成部分[2]。PR變性會導致不可逆的視功能損傷，包括年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)和糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)[3]等。PR變性的原因各異，其中視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cells, RPECs)的鐵死亡近年來受到越來越多學者的關注。作為血-視網膜外屏障的重要組件，RPECs及其構成的緊密連接負責脈絡膜向PR提供葡萄糖、氧和各類營養物質，同時排泄PR代謝產生的終產物，以實現PR的視覺功能。因此，RPECs鐵死亡可導致PR損傷甚至死亡，進而導致致盲性眼病的發生和發展[4]。本文將從鐵死亡的主要機制及其信號通路、RPECs功能下降相關眼病與RPECs鐵死亡的相關性及其機制、以及調控鐵死亡對RPECs相關眼病發生發展的作用進行綜述，以期為RPECs相關眼病發病機制的研究提供參考。

1鐵死亡的基本概念

依據形態學特征，細胞死亡可分為細胞凋亡、細胞自噬和細胞壞死三種類型。細胞凋亡和細胞自噬均是一種程序性細胞死亡，而細胞壞死是一種不可控性細胞死亡。近年來研究發現，細胞內存在其他死亡途徑，其中以Stockwell團隊提出的“鐵死亡”最受人們關注，并取得了顯著進展[5]。鐵死亡是一種由細胞內過量鐵積累和脂質過氧化引起的細胞死亡類型，在形態學、生物學和遺傳學上都不同于其他類型的細胞死亡。鐵死亡屬于調控性壞死，比細胞凋亡更具有免疫原性[6]。與正常細胞相比，鐵死亡的細胞線粒體尺寸減小，線粒體膜萎縮，線粒體嵴減少，雙層膜密度增加。細胞內脂質活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生和降解不平衡是導致鐵死亡的主要原因。鐵死亡誘導物直接或間接作用于谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidases, GPXs)，導致ROS積累，細胞抗氧化能力喪失，細胞氧化損傷[7]。

2 RPECs鐵死亡與RPECs功能下降相關眼病的相關性及其機制

新近研究表明，RPECs功能下降相關眼病的發生與RPECs鐵死亡造成的PR的變性有關。PR外節段的高濃度多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是PR內ROS的主要來源。過量光照會導致PR內ROS累積，介導氧化應激，進而引起PR損傷[8]。因此，視網膜需要特別的抗氧化保護[9]。視網膜內諸如谷胱甘肽(glutathione, GSH)和GPXs等多種細胞內抗氧化機制很好地發揮了此項功能，從而使RPECs的氧化損傷獲得一定程度的限制。隨著年齡增長，視網膜氧化還原系統的效率顯著下降，從而導致老年人群視網膜細胞更易受氧化應激的影響。目前有關RPECs鐵死亡的通路主要包括氨基酸轉運途徑、脂肪酸代謝途徑、鐵代謝途徑和炎癥反應途徑，分述如下。

2.1RPECs鐵死亡與SystemXc-/GPX4/GSH信號通路胱氨酸/谷氨酸轉運系統(System Xc-)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)和GSH通路是發現最早、最經典、目前研究最多的鐵死亡通路[5]，在RPECs中亦如此。System Xc-在細胞內發揮著重要的抗氧化功能，它通過細胞膜上的胱氨酸/谷氨酸轉運體溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)排出細胞內的谷氨酸(glutamic acid, Glu)，并攝取細胞外的胱氨酸(cystine, Cys)，將攝取的Cys還原為半胱氨酸(cysteine)，進而參與GSH的合成[10]。GSH是一種強效的還原劑，System Xc-合成的GSH可作為GPX4的輔因子，參與細胞內過氧化物的還原。GPX4是一種獨特的細胞內抗氧化酶，可直接消除細胞膜中產生的過氧化磷脂[11]。研究表明，使用GPX4抑制劑1S、3R-RSL3(RSL3)可增加溶酶體相關膜蛋白2(lysosome associated membraneprotein 2, LAMP2)基因敲除RPECs的細胞死亡量。補充半胱氨酸和谷氨酰胺可恢復GSH的功能，進而抑制ROS誘導的LAMP2敲除的RPECs死亡[12]。生理狀態下，在System Xc-/GPX4/GSH信號通路的有效調控下，細胞內脂質過氧化水平趨于穩定，從而有效抑制細胞的鐵死亡。Zhao等[13]對SLC7A11在脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)模型中的作用及其機制進行了初步探討，發現RPECs中SLC7A11蛋白的表達在激光處理小鼠后7d內持續增加。SLC7A11蛋白的表達在激光處理后前3d與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達峰值出現的時間一致，之后VEGF表達逐漸下降，至第7d時低于激光處理前水平，而腹腔注射SLC7A11抑制劑可使小鼠CNV的面積顯著增加。上述研究表明，SLC7A11可抑制RPECs對VEGF的表達，進而有效縮小CNV的面積。與體內實驗相對應，體外實驗也證實了SLC7A11在ARPE-19細胞(人RPECs細胞系)中廣泛表達，其對維持ARPE-19細胞的活力和抵抗細胞內脂質過氧化具有重要作用。敲除SLC7A11后，ARPE-19中的VEGF表達發生上調[13]。Scimone等[14]研究發現，用N-視黃醛-N-視黃乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine, A2E)誘導氧化應激后，人RPECs中GSH合成最佳限制酶谷氨酸/半胱氨酸連接酶修飾亞基(glutamate cysteine ligase modifier subunit, GCLM)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)和SLC7A11的表達發生下調，這些基因聚集在同一個富集通路上，即鐵死亡通路。GCLM下調會導致細胞內GSH生物合成減少，進而破壞鐵平衡，誘發RPECs鐵死亡。

2.2RPECs鐵死亡與PUFAs 高耗氧、持續光照、PUFAs超載以及光敏劑的存在會增加視網膜中ROS的聚集，從而激發視網膜氧化應激反應的發生[15-16]。鐵代謝過程中鐵的積累會加重ROS的形成，后者可與血漿和膜細胞器中的PUFAs反應生成脂質過氧化物。值得注意的是，PUFAs水平相對較高的細胞，如視網膜PR細胞，對脂質過氧化高度敏感，容易受到氧化應激導致其功能受損。而包括維生素E和GPX4在內的脂質抗氧化劑可降低PR細胞對脂質過氧化的敏感性[17]。視網膜PR細胞中較高的PUFAs含量可加重光氧化誘導的RPECs的衰老[18]，誘發RPECs鐵死亡，進而造成視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)功能下降。酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4)是一種重要的PUFAs代謝同工酶，對鐵中毒敏感性具有決定性作用。研究表明，ACSL4通過促進脂質過氧化而加重神經元的死亡，敲除ACSL4可抑制小鼠小膠質細胞促炎細胞因子的產生從而對小膠質細胞起到保護作用[19]。由此可見，ACSL4可通過促進促炎細胞因子的產生加重細胞的鐵死亡，但其在視網膜疾病中如何發揮作用有待進一步研究。

2.3RPECs鐵死亡與鐵代謝

2.3.1HFE和轉鐵蛋白與轉鐵蛋白受體HFE/Fe3+-Tf-TfR復合體通過RPECs基底外側膜進入細胞內，其釋放的Fe3+在鐵還原酶的作用下被還原為Fe2+。Fe2+通過二價金屬轉運體1(divalent metal transporter 1, DMT1)穿過核內體膜進入細胞質[20]。此過程中人類白細胞抗原Ⅰ類樣蛋白(HFE)、轉鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)的分布及含量在維持RPECs鐵穩態方面具有重要意義。HFE是主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)Ⅰ類樣蛋白，參與鐵穩態的維持。HFE通過與TfR1和TfR2相互作用識別Tf-結合鐵的飽和度[21-22]。HFE可與TfR1結合，一方面因其存在與轉鐵蛋白(transferrin, Tf)接觸的重疊位點而降低Fe3+-Tf結合TfR1的親和力[23]，另一方面因螺旋域上的Tf接觸區域允許同時結合，從而形成三元HFE/TfR1/Fe3+-Tf絡合物。HFE/Fe3+-Tf通過TfR1進入細胞，以動態靶點競爭的方式控制細胞內的鐵濃度[1]。此外，HFE還可與TfR2結合調節鐵氧化物酶鐵調素(hepcidin, Hepc)的轉錄，并通過觸發鐵轉運蛋白(ferroportin, FPN)的降解來抑制鐵攝取。HFE缺乏會導致鐵超載[24-25]。Martin等[21]研究發現，僅可在RPE基底外側膜檢測到HFE，表明HFE與TfR1/2相互作用介導脈絡膜血液中的鐵吸收進入視網膜。Gnana-Prakasam等[26]研究表明，HFE沉默的RPECs表現出衰老減少、遷移增強和葡萄糖攝取增加等腫瘤細胞的諸多特征。鐵超載的小鼠模型可觀察到RPECs肥大，而HFE缺失導致的鐵超載會誘發RPECs的氧化應激，進而促進RPECs過度增殖肥大，最終導致RPE失去其生理功能。

2.3.2DMT1與FPN1 DMT1是一種質子/Fe2+的轉運體，位于核內體膜上[20]，存在于RPECs、棒狀雙極細胞、水平細胞和PR內節段中。DMT1在受體介導的轉鐵蛋白-鐵的內吞作用下，促進Fe2+進入細胞質[22, 27]。未被RPECs使用或儲存的Fe2+通過FPN出細胞，在Hepc和血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin, Cp)作用下被氧化為Fe3+，并與細胞外Tf結合，形成鐵輸入-輸出循環[28]。新近研究發現，增高的鐵輸入蛋白DMT1和由增高的鐵調節蛋白1(iron regulatory protein 1, IRP1)下調的鐵輸出蛋白鐵轉運蛋白1(ferroportin 1, FPN1)均可引起鐵沉積[27]。此外，DMT1多態性是AMD潛在的環境相關風險標記物[29]。Datta等[8]研究發現，叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide, tBH)暴露后，FPN1表達下調，促進RPECs內Fe2+蓄積，進而誘發RPECs鐵死亡。

2.4RPECs鐵死亡與炎癥反應大量研究表明，ROS可導致視網膜細胞的損傷和視網膜疾病的發生，如AMD。ROS可使脂氧合酶(lipoxygenases, LOXs)代謝產物增加，LOXs與ROS反應誘導脂質過氧化，進而導致鐵死亡。Lee等[30]近期使用碘酸鈉(odium iodate, NaIO3)抑制RPE細胞系ARPE-19中5-LOX的功能，觀察其對ROS誘導細胞死亡的影響。作者同時在AMD小鼠模型中觀察NaIO3氧化應激后鐵死亡相關指標的變化。NaIO3處理后3d，RPE單層逐漸出現具有阿米巴、圓形或橢圓形的Iba1陽性染色的活性小膠質細胞和單核細胞。應用5-LOX的特異性抑制劑齊留通(抗白三烯類藥物)預處理后，Iba1陽性細胞數出現明顯下降，RPE細胞中的CD80、TNF等促炎基因的表達受到抑制。上述研究證實，NaIO3引起小鼠視網膜RPE丟失、炎癥損傷的機制是鐵死亡機制誘導的RPECs死亡，而5-LOX的抑制劑齊留通通過抑制鐵死亡從而減輕NaIO3誘導的小鼠視網膜的損傷和RPE單層細胞的變性。Scimone等[14]發現，應用A2E處理培養的人RPECs 3h后，包括GCLM、HO-1和SLC7A11在內的鐵死亡相關信號分子表達下調，促炎細胞因子表達上調，這一結果與培養的人RPECs中白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-1(interleukin-1, IL-1)信號通路相對富集有關。上述研究表明，在氧化應激條件下，RPE試圖通過增加IL-6、IL-1等炎癥因子的表達來拯救PR，結果觸發炎癥級聯導致感光細胞的進一步損傷，進而使PR細胞功能損傷的進程進入惡性循環，最終出現諸如AMD、DR和RP的典型PR功能受損的疾病特征[31]。

3 調控鐵死亡對RPECs相關眼病發生發展的作用

雖然“鐵死亡”概念的提出至今不過10a時間，其分子機制及調控通路已取得重大突破。在眼科領域，RPECs鐵死亡的調控性研究涉及多種眼病，包括AMD、RP和DR等。早在1960年代，鐵就被認為可參與視網膜脂質過氧化過程，這一作用可通過維生素E來預防[17]。新近研究指出，食物中補充具有脂質抗氧化特性的營養物質(如葉黃素、玉米黃質、鋅、維生素C、維生素E以及β-胡蘿卜素)可降低AMD進展的風險，其機制可能與上述營養物質可降低RPECs鐵死亡的敏感性從而發揮其對神經視網膜細胞的保護作用有關[32-33]。最近又有報道，應用鐵抑制素(ferrostatin-1, Fer1)和去鐵胺(deferoxamine, DFO)抑制tBH誘導的RPECs鐵死亡，可獲得比單純的凋亡或壞死抑制劑更好的視網膜保護效果[34]。該研究為RPECs功能障礙和PR細胞凋亡所致的干性AMD的治療提供了一種潛在的方法。Zhao等[13]研究發現，應用SLC7A11抑制劑或敲除SLC7A11基因可增強ARPE-19細胞的脂質過氧化水平，降低體外培養的ARPE-19的活力，而應用Fer1抑制鐵死亡途徑后，ARPE-19細胞的活力獲得顯著逆轉。相反，過表達SLC7A11可顯著抑制鐵死亡誘導劑愛拉斯汀(erastin)或RSL3的功能，對ARPE-19細胞的活力具有明顯的保護作用。作者進一步研究發現，敲除調控轉錄因子NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2, NRF2)后，SLC7A11的表達發生明顯下調。上述研究證明，SLC7A11和NRF2可能成為AMD治療的新靶點。Tang等[35]通過直接敲除HO-1或應用HO-1抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin, ZnPP)發現，特異性抑制HO-1可顯著降低RPECs的鐵死亡。他們認為ZnPP可抑制RPECs變性，從而有效保護視網膜結構和視覺功能。上述研究表明，抑制HO-1介導的RPECs鐵死亡可能成為視網膜退行性疾病(如AMD、RP和DR等)的另外一條有效的策略。5-LOX的特異性抑制劑齊留通可減少NaIO3誘導的RPECs脂質過氧化[30]，減輕視網膜炎癥反應，減少神經視網膜和RPECs的變性，從而有效減少PR細胞的死亡。抑制LOXs或許亦可成為AMD治療的新方向。RP的特點是PR細胞的不可逆損傷，RPECs的鐵死亡參與該過程。目前針對RP的治療缺乏有效的方法，除使用鐵螯合劑外，增強與鐵死亡相關的GSH和GPX4的表達[36]，降低ACSL4的表達[19]，可能對RP病情的進展起到一定的延緩作用。Singh等[37]發現，在高糖環境下培養的ARPE-19中加入花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase, ALOX5)抑制劑抑制PUFAs的過氧化，可削弱ARPE-19的鐵死亡，從而對高糖環境下培養的ARPE-19細胞的活力產生保護作用。上述研究為抑制鐵死亡在DR治療上的作用提供了新的思路。

4 總結與展望

大量研究證實，靶向抑制RPECs鐵死亡的相關信號通路對RPECs損傷相關眼病的進展具有顯著的抑制作用。近年來，隨著鐵死亡相關信號通路研究的不斷深入，鐵死亡機制在眼病發生發展過程中扮演的角色也越來越受到眼科領域學者的重視。鐵死亡參與RPECs損傷相關眼病的機制主要涉及System Xc-/GPX4/GSH信號通路、PUFAs途徑、鐵代謝途徑和炎癥反應途徑，而它們是如何調控包括RPECs在內的視網膜細胞的損傷，參與眼病的發生與發展，這些機制尚不清楚。此外，CoA/PUFAs、DMT1/FPN1/IL-6通路如何在RPECs鐵死亡中發揮作用，如何調控這些通路來治療包括AMD、RP和DR在內的眼病，有待進一步研究解釋。相信在不久的將來，隨著對鐵死亡機制研究的進一步深入，RPECs損傷相關眼病的治療也必將迎來新的突破。