基于高通量測序技術的不同產(chǎn)地腐乳微生物多樣性分析

付瑞敏，劉春雷，徐 良，張 紅，夏鐵騎，陳五嶺

（1.河南財政金融學院體育與健康管理學院，河南鄭州 450046；2.陜西師范大學食品學院，陜西西安 710069）

腐乳，又稱為“東方奶酪”，是我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，它起源于我國大約兩千年前的魏朝，因其獨特的營養(yǎng)和功能成分、芳香和風味特性而被國人廣泛用作調味品和開胃菜[1]。經(jīng)過微生物發(fā)酵后的腐乳以其低膽固醇、高蛋白和高鈣等營養(yǎng)特點而被人們認為是一種健康食品。根據(jù)參與發(fā)酵的微生物類型不同，可將腐乳分為細菌發(fā)酵、霉菌發(fā)酵和自然發(fā)酵等三種類型。其中，以放線菌、毛霉和根霉為發(fā)酵劑的霉菌發(fā)酵法最為普遍[2]。

腐乳中的微生物可代謝合成產(chǎn)生多種風味物質，其群落構成在調節(jié)腐乳產(chǎn)品風味方面發(fā)揮著重要作用，被認為是決定腐乳最終質量的關鍵因素[3-5]。腐乳發(fā)酵前期，葡萄球菌屬、明串珠菌屬和毛霉屬占據(jù)了優(yōu)勢，其酶系分泌活躍，使得產(chǎn)品中谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等含量有較大幅度增長，苯丙氨酸和亮氨酸可進一步形成醇類化合物，這些醇類化合物可和霉菌分泌的脂肪酶降解豆腐中粗脂肪所產(chǎn)生的脂肪酸以及細菌代謝產(chǎn)生的乙酸、乳酸等發(fā)生酯化反應，進而產(chǎn)生乳酸乙酯、乙酸乙酯等風味物質[6]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬也可分解蛋白和脂肪，在腐乳后發(fā)酵階段產(chǎn)生醇類、酯類和吡嗪類等風味物質；這些微生物通過合成代謝產(chǎn)生各種風味物質。不同的微生物組成受其產(chǎn)地的環(huán)境群落及氣候特點等多種因素的影響，這導致不同產(chǎn)地的腐乳中微生物群落存在復雜多樣的差異[7]。因此，闡明腐乳發(fā)酵過程中微生物的組成及其與食品性質的關系，并在此基礎上對腐乳發(fā)酵進行合理的菌群設計是進一步提高腐乳發(fā)酵質量的必要條件。當前，有許多研究使用純培養(yǎng)技術來揭示腐乳中的優(yōu)勢菌群，但這種技術受限于純培養(yǎng)，對于含量較低、沒有菌株分離、培養(yǎng)和鑒定過程的情況無法對腐乳中的整體微生物概況進行全面分析[8]。

近年來，隨著測序技術的不斷發(fā)展，高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）作為新一代測序技術以其價格低廉、可讀量大等優(yōu)點被廣泛用于探索各種豆豉、醋和米酒等生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性，徐瓊等[9]采用高通量測序技術分析不同地區(qū)紅腐乳的細菌多樣性，然而關于腐乳細菌及真菌的微生物群落同其產(chǎn)地和化學成分之間關系的研究還鮮見報道。

基于此，本研究以我國東部、南部和北部等不同地區(qū)所產(chǎn)的16種腐乳為研究對象，采用高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術對腐乳中的細菌16S rRNA基因和真菌內(nèi)部轉錄間隔區(qū)2（ITS2）基因進行測序，并針對腐乳中微生物多樣性、關鍵微生物種屬與腐乳化學性質、區(qū)域分布和調味處理的相關性展開研究，以期為提高傳統(tǒng)發(fā)酵調味品的品質提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16種腐乳樣品 通過京東、淘寶等線上平臺購自國內(nèi)華東、華南和華北地區(qū)，具體編號、品牌、產(chǎn)地及調味方式如表1所示；實驗中所用試劑 均購自鄭州優(yōu)吉生物科技有限公司，所有試劑純度均為分析純；磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒（DP705） 天根生化科技有限公司。

表1 腐乳16種樣品的產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 16 sufu samples

歐萊博9830凱氏定氮儀 濟南歐萊博科技有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機有限公司；Sub-Cell GT電泳儀 美國伯樂；NanoPhotometer N60分光光度計 德國implen；Gene Amp 9700PCR儀 成都東勝科創(chuàng)；GelSMART凝膠成像儀 北京海鵬翔；Illumina Miseq高通量測序平臺 上海派森諾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取和高通量測序

1.2.1.1 DNA提取 從16種不同的腐乳產(chǎn)品中各取1.0 g腐乳樣品，使用基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA的提取和純化。參考余巨全等[10]的方法，對所得到的基因組DNA進行純度和濃度檢測。吸取1.0 μL的DNA將其加至分光光度計中以檢測所得基因組DNA中A260與A280的比值，以檢測所得DNA的純度；吸取2.5 μL的DNA將其加至1%的瓊脂糖凝膠中，并將所得結果置于凝膠成像系統(tǒng)下進行成像以檢測所得DNA的濃度。

1.2.1.2 PCR擴增 針對細菌16S rDNA基因的V3和V4區(qū)域合成帶barcode的引物338F 5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3'、806R 5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'，針對真菌rRNA ITS2的保守序列合成帶barcode的引物5'-TCCGTAGGTGGA ACCTGCGG-3'、5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。以所提取的DNA為模板，使用Gene Amp 9700PCR儀進行PCR擴增，PCR擴增體系：基因組模板DNA 2 μL，5×PCR Master Mix 5 μL，正反引物各0.5 μL，用雙蒸水補足至25 μL。細菌PCR擴增條件：94 ℃預處理3 min；30循環(huán)（94 ℃變性25 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃延伸5 min。真菌PCR擴增條件：94 ℃預處理3 min；32循環(huán)（94 ℃變性30 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃延伸5 min。用0.01 g/mL瓊脂糖凝膠電泳進行檢測擴增出的PCR產(chǎn)物并使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，而后使用Illumina Miseq進行高通量測序。

1.2.2 腐乳樣品的化學成分測定

1.2.2.1 樣品處理 取腐乳樣品20 g并將其分別置于研缽中，用杵磨成糊狀，然后用80 mL去離子水在60 ℃下溶解。將混合物輕輕攪拌并煮沸，然后轉入200 mL的容量瓶中，用水稀釋至總體積200 mL。將制備好的腐乳懸浮液過濾，取濾液進行化學成分的測定。

1.2.2.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定 以蒸餾水為空白對照，吸取10 mL的樣品濾液，將其加入盛有90 mL蒸餾水的三角瓶（250 mL）中，將其充分混勻后，再加入10 mL的甲醛溶液（濃度為0.36 g/mL），用濃度為0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液進行滴定，直至pH為9.2，通過計算氫氧化鈉溶液的消耗量來計算腐乳樣品中的氨基氮含量[11]。

1.2.2.3 水溶性蛋白質含量的測定 以蒸餾水為空白對照，吸取10 mL的樣品濾液，將其加入盛有50 mL蒸餾水的三角瓶（150 mL）中，充分混勻后100 ℃水浴加熱10 min，待溫度降至室溫后將其轉入容量瓶（100 mL）中，參照GB 5009.5-2016中的第一法進行水溶性蛋白質的測定，其中蛋白質的換算系數(shù)為5.71[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用測序數(shù)據(jù)質控軟件Trimmomatic對原始FASTQ文件進行質量控制。使用UPARSE7.1軟件（http://drive5.com/uparse/）對操作分類單元（operational taxonomic unit，OTUs）進行預聚類，其序列一致性截斷率為97%。真菌ITS和細菌16S rRNA的所有操作分類單元均采用核糖體數(shù)據(jù)庫程序（RDP）分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）對Silva（SSU128）數(shù)據(jù)庫進行分類，置信閾值為70%。

使用美吉生物云平臺的（www.majorbio.com）的免費在線平臺對所獲序列進行生信統(tǒng)計分析。使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）的α多樣性模塊對樣品中Shannon、Simpson、Coverage和Chao1指數(shù)進行alpha多樣性統(tǒng)計與分析，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表樣品中的菌落多樣性，coverage代表樣品文庫的覆蓋率、Chao1指數(shù)代表菌落豐度。使用Mann-Whitney檢驗對樣本間各操作分類單元（OTU）相對豐度進行統(tǒng)計差異分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Majorbio Cloud platform（www.majorbio.com）的免費在線平臺進行主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。最后使用R語言進行微生物群落組成與腐乳化學成分之間的典范對應分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結果與分析

2.1 腐乳樣品的文庫構建及測序數(shù)據(jù)分析

使用高通量測序技術，對來自不同地區(qū)的16份腐乳樣品進行微生物多樣性分析。共獲得1032656個真菌群落的讀數(shù)（OTU范圍從22到239）以及689359個細菌群落的讀數(shù)（OTU范圍從68到289），樣品中真菌ITS和細菌16S rRNA序列的覆蓋度均大于99.90%，具有較好的微生物群落代表性。對所得樣本序列進行隨機取樣，將抽到的樣本序列與其代表的OTU數(shù)目構建稀釋曲線，并以此來對測序數(shù)據(jù)量的合理性予以說明。所得結果如圖1所示，由圖1可知，16個腐乳樣本的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，文庫構建合理，測序深度可較好地反映微生物群落的信息[13]。

圖1 16種腐乳樣品的稀釋性曲線Fig.1 Dilution curves in the 16 sofu samples

2.2 腐乳樣品的真菌多樣性分析

α多樣性分析可反映測序樣本中微生物群落的物種豐度和多樣性，本研究采用ACE、Chao1、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)對對腐乳樣本中的真菌α-多樣性進行評價，所得結果如表2及圖2～圖3所示。

表2 16種腐乳樣品中真菌的α多樣性分析Table 2 α diversity analysis of fungi in 16 sofu samples

其中，表2中的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)代表的是樣本中微生物菌落的豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表的是樣本中微生物菌落的多樣性，但具體代表的值有所差別。Shannon指數(shù)值越大，代表微生物群落的多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，卻代表微生物群落多樣性越低。Coverage指的是所測樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值的高低反映了所得到的測序結果是否完全代表樣本的微生物群落[9]。從表2中可看到，所有樣本的覆蓋率均大于99%，說明文庫的覆蓋率基本涵蓋樣本中所有序列，本次測序結果可以代表樣本中微生物的真實情況。

在真菌多樣性方面，16個樣本中的BJ18以最高的ACE（246.280）、Chao1（242.667）、Shannon指數(shù)（4.231）和最低的Simpson指數(shù)（0.046）而展現(xiàn)出最高的真菌豐度和多樣性。BJ19和SH8分別以較低的ACE（27.057和46.035）和Chao（25.667和45.333）以及較高的Simpson指數(shù)（0.557和0.706）展現(xiàn)出較低的真菌豐度和多樣性。在腐乳樣品中，數(shù)量最多的5個真菌屬分別為土赤殼屬（Ilyonectriasp.）、剛毛藻屬（Cadophorasp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、指趾藤屬（Dactylonectriasp.）和瓶霉菌屬（Phialophorasp.）（圖2），平均占真菌群落組成的56.08%。此外，不同的腐乳樣品在真菌屬成分上存在顯著差異，這可能與腐乳產(chǎn)地、發(fā)酵原料和發(fā)酵工藝的不同有關[14]。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）腐乳16個樣品所得到的真菌屬相對豐度百分比如圖2所示。16種腐乳樣品中的微生物群落主要由土赤殼屬（Ilyonectriasp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）、酵母屬（Saccharomycopsissp.）、放射毛霉屬（Actinomucorsp.）、假絲酵母屬（Candidasp.）、根霉屬（Rhizopussp.）等胞外水解酶產(chǎn)生菌組成。此外，還存在剛毛藻屬（Cadophorasp.）、枝孢屬（Cladosporiumsp.）、束毛藻屬（Trichomeriumsp.）、瓶霉屬（Phialophorasp.）和鐮刀菌屬（Fusariumsp.）等大量的大豆共生體和病原菌。在產(chǎn)生水解酶的屬中，放射毛霉屬（Actinomucorsp.）在除了SH8和BJ19的其余14個腐乳樣本中均有分布，而根霉（Rhizopussp.）分布比較有限，僅在ZJ1（2.11%）中被檢測出；綜合對比各樣本中的真菌多樣性，推測放射毛霉屬（Actinomucorsp.）比其他絲狀屬更適合作為腐乳生產(chǎn)發(fā)酵劑中的水解酶生產(chǎn)菌[15]。此外，在16個腐乳樣品中均檢測到了曲霉屬（Aspergillussp.），平均占所有屬的8.65%，在樣本SH8中更是以85.32%的比例占絕對優(yōu)勢。有報道稱曲霉在腐乳生產(chǎn)過程中的后發(fā)酵中非常重要并占主導地位[16]，這與本研究的結果一致。

圖2 16種腐乳樣品中真菌屬的相對豐度百分比（%）Fig.2 Relative abundance percentages (%) of the fungal genera in 16 sufu samples

利用主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）對16種腐乳中真菌組成的異同進行了分析，所得結果如圖3所示。根據(jù)PCoA圖，主坐標成分PC1和PC2分別占真菌群落方差的36.98%和18.86%。中國東部地區(qū)的真菌（ZJ2、ZJ4、ZJ5、ZJ6、SH9、AH11和JX12）可以歸為一組，說明腐乳的真菌群落可能受地理因素的影響，因為來自同一地區(qū)的樣品在進行腐乳發(fā)酵制備時通常具有相似的溫度和水分條件[17]。除此之外，課題組研究發(fā)現(xiàn)，中國南方（GD14、GL15、LGM16）和中國北方（JL17、BJ18和BJ20）各樣本間的距離均比較近，表明這些樣本之間的菌群差異性較小，可歸為一類，這表明除了地理因素之外，還有其它因素可影響腐乳真菌的多樣性。這些腐乳產(chǎn)品可能使用類似的接種發(fā)酵劑、大豆原料或預發(fā)酵工藝[18]，這還需要進一步確認。另一方面，花香調味的ZJ1、ZJ4、ZJ5、SH9、BJ19以及酒香調味的ZJ2、ZJ6、SH8、AH11、GL15、JL17、BJ20和香辛調味的JX12、GD14、GZ16、BJ18這3組不同調味香料的樣品在PCoA圖中呈現(xiàn)不規(guī)則的分布，這表明調味香料不是影響腐乳中真菌群落組成的主要因素。

圖3 16種腐乳樣品中真菌組成的主坐標分析（A）和層次聚類分析（B）Fig.3 Principal coordinate analysis (A) and hierarchical cluster analysis (B) of the fungal genus compositions among 16 sufu samples

2.3 腐乳樣品中的細菌多樣性分析

16種腐乳樣品的細菌α多樣性檢測結果如表3所示。在細菌多樣性方面，16個樣本中的ZJ1以最高的ACE（230.465）、Chao（186.895）、Shannon指數(shù)（1.117）和最低的Simpson指數(shù)（0.297）而展現(xiàn)出最高的細菌豐度和多樣性。BJ19和GZ16分別以較低的ACE（39.697和86.113）和Chao（39.500和85.857）以及較高的Simpson指數(shù)（0.523和0.565）展現(xiàn)出較低的細菌豐度和多樣性。對比真菌的α多樣性結果，BJ19的細菌α多樣性與真菌的α多樣性結果一致，說明該產(chǎn)品在腐乳的發(fā)酵過程中應該是選用了特殊的發(fā)酵或加工方法[19]。此外，ZJ2和JX12的Shannon值最高，分別為2.187和2.162，Simpson值最低，分別為0.321和0.153，說明其菌群分布較其他樣本更為均勻。而AH11的Shannon值最低（0.844），Simpson值最高（0.677），表明該樣品中以少數(shù)物種為主[20]。

表3 16種腐乳樣品中細菌的α多樣性分析Table 3 α diversity analysis of bacteria in 16 sufu samples

16個腐乳樣品中細菌屬的相對豐度百分比如圖4所示，16份腐乳樣品中平均菌群含量排名前6位的是乳球菌屬（Lactococcussp.）（33.83%）、芽孢桿菌（Bacillussp.）（11.79%）、四聯(lián)球菌（Tetragenococussp.）（7.72%）、腸桿菌（Enterobactersp.）（6.36%）、鏈球菌（Streptococcuasp.）（6.10%）和明串珠菌（Leuconostocsp.）（5.72%），占菌群組成的71.52%，這與alpha多樣性分析結果一致，即細菌群落傾向于以少數(shù)物種為主[21]。

從圖4中還可以看到，腐乳樣品中的細菌群落由可水解蛋白的芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、魏斯氏菌屬（Weissellasp.）、梭菌屬（Clostridiumsp.）、腸球菌屬（Enterococcussp.）、棒狀桿菌屬（Corynebacteriumsp.）等增味菌和不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）等潛在的致病性或腐敗菌株組成。所有腐乳產(chǎn)品中，乳球菌屬（Lactococcussp.）最占優(yōu)勢，在腐乳樣本ZJ1、GL15、SH9、JL17、ZJ2、ZJ5和GZ16中分布范圍高達42.28%～76.69%。鏈球菌（Streptococcussp.）在SH8和BJ19中分布范圍高達59.04%和16.36%。明串珠菌屬（Leuconostocsp.）在樣品SH9、GZ16和GD14中分別為35.21%、21.47%和13.67%。魏斯氏菌屬（Weissellasp.）在BJ19、JX12和BJ20中的分布占12.68%、10.14%和10.00%。樣品JL17中以乳酸菌（Lactobacillussp.）含量較高，為32.66%。這些不同樣品中的微生物組成支持了乳酸菌在腐乳發(fā)酵中的重要性和復雜機制。此外，從圖4中看到，芽孢桿菌菌株廣泛存在于樣品AH11、JX12和GD14中，但在許多其他腐乳樣品中分布較少。

圖4 16種腐乳樣品細菌屬的相對豐度百分比（%）Fig.4 Relative abundance percentages (%) of the bacterial genera in 16 sufu samples

利用主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）對16種腐乳中細菌組成的異同進行了分析，所得結果如圖5所示。與真菌群落相似，不同腐乳樣品的細菌群落差異顯著。16種腐乳樣品大體可分為乳酸桿菌類進化支（ZJ2、ZJ5、SH9、ZJ1、GL17、BJ20）和芽孢桿菌進化支（ZJ4、ZJ6、AH11、JX12、GD14）。這與之前對黃酒發(fā)酵的研究一致，8種發(fā)酵劑中有4種菌群以乳酸菌為主，而其余4個以芽孢桿菌為主。芽孢桿菌能提供多種水解酶，加速發(fā)酵物質中蛋白質、脂類和碳水化合物的降解，但芽孢桿菌對腐乳發(fā)酵的起源、影響及意義有待進一步研究。與真菌群落不同的是，樣品中的細菌群落沒有按區(qū)域進行聚類，說明腐乳樣品中的細菌群落具有較強的變異性，可能受到多種因素的影響。與真菌群落相似，16種不同產(chǎn)品的菌群在發(fā)酵后也不能很好地按照調味方式進行聚類。因此可得出以下結論：腐乳中的細菌群落比真菌群落變化更大，其群落多樣性在發(fā)酵后可能受到氣候變化、浸泡和鹽漬等高滲處理等多種因素的影響。

圖5 16種腐乳樣品中細菌屬組成的主坐標分析（A）和層次聚類分析（B）Fig.5 Principal Coordinate Analysis (A) and Hierarchical Cluster Analysis (B) of the bacterial genus compositions among 16 sufu samples

2.4 腐乳樣品中的化學成分分析

對選自華東、華南、華北等不同產(chǎn)地的16份腐乳樣品中可溶性蛋白和氨基氮含量等化學成分進行檢測，所得結果如表4所示。從表中可以看出，不同產(chǎn)地對于腐乳中的化學成分具有一定的影響，比如，華東產(chǎn)區(qū)中，產(chǎn)自浙江的腐乳樣品（ZJ1、ZJ2、ZJ4、ZJ5、ZJ6）和產(chǎn)自上海的腐乳樣品（SH8和SH9）中的可溶性蛋白含量和氨基氮含量彼此間比較接近，說明這些腐乳樣品中所使用的發(fā)酵劑菌種具有較為相近的產(chǎn)蛋白酶能力。同時，產(chǎn)自安徽和江西的腐乳樣品（AH11）和（JX12）可溶性蛋白含量和氨基氮含量明顯高于其它華東地區(qū)的腐乳樣品，結合前邊的細菌豐度檢驗結果，推測是由于這兩種樣品中含量較為豐富的芽孢桿菌作用所致，為驗證該推測，課題組又檢測了也具有高豐度的芽孢桿菌分布的產(chǎn)自華南地區(qū)GD14樣品中的可溶性蛋白和氨基氮含量，發(fā)現(xiàn)該腐乳樣品也具有較高的可溶性蛋白和氨基氮含量，這說明芽孢桿菌在腐乳發(fā)酵的蛋白質分解中扮演極為重要的角色。

表4 16種腐乳樣品的化學成分測定Table 4 Chemical determination of 16 different sufu samples

3 討論

研究表明，醬油、醋、腐乳等發(fā)酵調味品中的微生物組成是決定其最終質量的關鍵因素[22]。本研究基于高通量測序技術，將腐乳發(fā)酵過程中微生物群落、化學成分、產(chǎn)地及風味相關性進行了探討分析，以期揭示腐乳發(fā)酵過程中微生物多樣性的影響因素及潛在后果。

研究中課題組發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)所產(chǎn)的腐乳樣本中的真菌群落可大致分為一類，這說明了地理因素在腐乳發(fā)酵過程中的重要作用。然而，腐乳樣品中的細菌群落就不能很好地按照地域進行聚類，這表明細菌群落在腐乳發(fā)酵過程中的變異性更大，除去地理條件之外，還可能受到加工技術及發(fā)酵環(huán)境因素的影響，這和前人的報道相一致[23]。

微生物多樣性分析有助于揭示腐乳發(fā)酵的關鍵菌群和功能菌群，為今后腐乳發(fā)酵菌群的合理設計提供依據(jù)。結果表明，放射毛霉屬（Actinomucorsp.）作為產(chǎn)水解酶的真菌，在腐乳發(fā)酵過程中起著極為重要的作用，通過分析16種腐乳樣品的真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)放射毛霉屬（Actinomucorsp.）作為優(yōu)勢菌以較高的豐度百分比廣泛分布于華南、華東和華北等多個產(chǎn)地的腐乳樣品樣本（GD14、ZJ1、AH11、BJ20）中；此外，課題組也在16種腐乳樣品中檢測到大量的可產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等水解酶的曲霉屬（Aspergillussp.），這些曲霉因其可廣泛增加可溶性蛋白含量和氨基氮水平等特點被廣泛用于豆制品的食品發(fā)酵中，腐乳樣品的真菌多樣性分析結果說明毛霉和曲霉對于腐乳的發(fā)酵生產(chǎn)具有極為重要的作用。陳卓等發(fā)現(xiàn)放射毛霉屬是紅腐乳發(fā)酵前期的主要菌種之一，紅曲霉在發(fā)酵后占主導地位，該觀點和本研究所得結果一致[24]。

本研究中根據(jù)細菌屬的豐度，可將16種腐乳樣品的細菌群落分為兩大進化支：乳酸菌進化支和芽孢桿菌進化支。這兩個分支的存在引起了課題組對于芽孢桿菌在豆制品發(fā)酵中的潛在作用的關注。芽孢桿菌是對食品發(fā)酵至關重要的菌種[25]，它可以產(chǎn)蛋白酶等水解酶，因而在腐乳的發(fā)酵和成熟中發(fā)揮重要作用；本研究通過對比AH11、JX12和GD14這三個產(chǎn)地的細菌多樣性結果和化學成分的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)腐乳樣品中可溶性蛋白和氨基氮的含量同芽孢桿菌的含量呈現(xiàn)正相關，這為后期針對不同用戶需求設計生產(chǎn)腐乳發(fā)酵劑提供了理論依據(jù)。此外，腐乳樣品中的細菌多樣性分析結果顯示，包括乳球菌屬（lactococcussp.）和鏈球菌（Streptococcuasp.）在內(nèi)的乳酸菌廣泛地存在于16種腐乳樣品中，研究顯示，這些菌群腐乳pH及風味的維持及生物防腐等方面發(fā)揮著重要影響[26]。

HTS技術可有效地揭示腐霉樣品中細菌和真菌生態(tài)系統(tǒng)的整體狀況。采用高通量測序，不僅檢測出毛霉、曲霉和芽孢桿菌以及乳酸菌等優(yōu)勢菌群在各樣品中的分布豐度，也檢測出短梗霉（Aureobasidiumsp.）、聚孢霉（Clonostachyssp.）和金黃桿菌屬（Chrysobacteriumsp.）等腐乳中的一些稀有屬在AH11、ZJ2、SH9、ZJ5、ZJ6和ZJ4等樣本中具有豐富的含量。研究表明，這些稀有屬均來自于大豆材料[27]，且其存在會影響腐乳發(fā)酵微生物群落的組成[28-29]，具體影響機制還需要對腐乳發(fā)酵過程中微生物多樣性及其特性的動態(tài)變化做進一步的研究。