ORAOV1、CD133和KiSS-1在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義*

吳志剛 胡凱 楊東昆 劉暢

2012 年全球新發(fā)口腔癌病例（包括唇癌）估計 為300 000 例，死亡病例約為145 000 例[1]。口腔鱗狀細胞癌（OSCC）約占所有診斷為口腔癌的90%。在中國，口腔癌的主要危險因素有吸煙、飲酒、檳榔及HPV 感染[2-3]?？谇话┻^度表達1（oral cancer overexpressed 1，ORAOV1）蛋白，最初被確定為口腔鱗狀細胞癌中的候選癌基因[3]。該基因位于人類染色體11q13。越來越多的證據(jù)表明，ORAOV1 與細胞周期、細胞凋亡、血管生成和腫瘤發(fā)生有關[4]。ORAOV1 的過表達能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，應被視為預測轉(zhuǎn)移和預后的生物標志物。腫瘤干細胞由于其在腫瘤細胞群體中具有自我更新能力和高致瘤性，因此被認為在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)中起重要作用[5]。造血干細胞抗體CD133 是腫瘤干細胞中最常見的一個標志物，其可以抑制癌細胞凋亡[6]。吻素-1（KiSS-1）基因最初通過消減雜交分析被確定為人類黑色素瘤的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因位于人類染色體1q32 上，長度為6 151 個堿基對。KiSS-1 可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）與啟動子的結(jié)合來促進上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）表達并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達。KiSS-1 的正常表達可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移從而抑制其趨化性和侵襲性[7]。一些證據(jù)表明KiSS-1 可以抑制癌癥的轉(zhuǎn)移而不影響致瘤性[7]。KiSS-1 編碼一個145 個氨基酸的肽，該肽被進一步切割為KiSS-1 家族肽素。然而，KiSS-1抑制轉(zhuǎn)移的機制仍不清楚。本研究主要通過免疫組化方法檢測ORAOV1、CD133 和KiSS-1 在OSCC 中的表達情況，并分析它們之間的相互關系及臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 一 般資料 選取2012 年1 月-2014 年12 月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科100 例確診為OSCC 患者的標本及相應的100 例正常組織作為對照。納入標準：（1）年齡20～80 歲；（2）病理診斷為OSCC；（3）臨床分期Ⅰ～ⅣA 期。排除標準：（1）選取標本前已接受抗癌治療；（2）伴有嚴重心、肺、腦疾?。唬?）合并其他腫瘤。所有組織樣本均在患者書面同意的情況下獲得。該研究得到蚌埠醫(yī)學院倫理委員會批準。隨訪時間從患者的手術(shù)日期到他/她的死亡日期或2020 年12 月。

1.2 方法 所有OSCC 標本和對照標本均采用4%中性福爾馬林溶液固定后石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，然后用二甲苯及梯度濃度的乙醇溶液連續(xù)脫蠟、脫二甲苯至水洗。ORAOV1、CD133 和KiSS-1蛋白的免疫組化染色步驟根據(jù)試劑盒說明書操作，陽性對照采用說明書指定的陽性切片，空白對照用PBS 液替代一抗。兔抗人多克隆抗體ORAOV1 購自英國Abcam 公司，鼠抗人單克隆抗體CD133 和KISS-1 購自美 國Santa Cruz 公 司。ElivisionTMPlus和DAB 顯色試劑盒購自中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 觀察指標及判定標準 ORAOV1 主要定位于細胞核，CD133 主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，KiSS-1主要定位于細胞漿。陽性結(jié)果的判定主要是根據(jù)染色強度和染色范圍分別計分相乘后得出的。陽性強度評分如下：無著色為0 分；淡黃色為1 分；黃色為2 分；棕黃色為3 分。根據(jù)陽性細胞百分比對陽性程度進行評分：≤10%為1 分；11%～50%為2 分；51%～75%為3 分；＞75%為4 分。將染色強度和染色范圍相乘，得出一個介于0～12 的值。根據(jù)均數(shù)來計算，若積分≥3 分為陽性表達，＜3 分為陰性[8]。免疫組化標記染色結(jié)果的判定是由兩位高年資病理醫(yī)師通過獨立雙盲法得出的。

1.4 統(tǒng)計學處理 利用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 對本試驗中數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用卡方檢驗比較臨床病理參數(shù)與ORAOV1、CD133 或KiSS-1 之間的相關性。ORAOV1、CD133 或KiSS-1 蛋白表達之間關系采用列聯(lián)表相關檢驗?；颊咧委熀罂偟纳鏁r間利用Kaplan-Meier 法分析，通過log-rank 法檢驗；多因素回歸分析通過Cox 法分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的表達 及其與OSCC 臨床參數(shù)之間的關系 ORAOV1 結(jié)果在OSCC標本中的陽性表達率為60%（60/100），高于相應的正?？谇火つそM織的20%（20/100）（χ2=33.333，P＜0.001）。CD133 在OSCC 組織中 的陽性表達率60%（60/100），高于相應的正?？谇火つそM織的18%（18/100）（χ2=37.074，P＜0.001）。KiSS-1 表達在OSCC 組織中的陽性表達率為46%（46/100），低于相應的正?？谇火つそM織的91%（91/100）（χ2=46.924，P＜0.001）。不同年 齡、性 別、位置、吸煙、酗酒、直徑、分化程度OSCC 患者的ORAOV1、ORAOV1、KiSS-1 蛋白的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期OSCC 患者的ORAOV1、ORAOV1、KiSS-1 蛋白的表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 ORAOV1、CD133和KiSS-1與OSSC臨床病理參數(shù)之間的關系（例）

2.2 OSCC 中ORAOV1、CD133 和KiSS-1 表達的 相關性 列聯(lián)表相關分析顯示，KiSS-1 表達與ORAOV1、CD133 表達均 呈負相 關（P＜0.001）。ORAOV1 的表達與CD133 的表達呈正相關（P=0.003），見表2～4。

表2 ORAOV1與KiSS-1的關系分析（例）

表3 CD133與KiSS-1的關系分析（例）

表4 CD133與ORAOV1的關系分析（例）

2.3 影響生存時間的單因素分析 隨訪數(shù)據(jù)顯示，ORAOV1 陽性表達OSCC 患者的總生存時間（OS）為（43.7±18.4）個月，低于陰性表達OSCC 患者的（71.0±14.6）個月（log-rank χ2=37.015，P＜0.001），見 圖1A。CD133 陽性表 達OSCC 患者的OS 為（43.2±16.9）個月，低于CD133 陰性表達OSCC患者的（71.8±15.8）個 月（log-rank χ2=46.317，P＜0.001），見圖1B。KiSS-1 陽性表達OSCC 患者的OS 為（71.4±13.8）個月，高于KiSS-1 陰性表達患者的（40.3±16.1）個月（log-rank χ2=65.535，P＜0.001），見圖1C。

圖1 ORAOV1、CD133和KiSS-1陽性與陰性表達OSCC患者生存曲線

2.4 影響生存時間多因素分析 多因素分析顯示，ORAOV1、CD133、KiSS-1 蛋白可能是影響OSCC患者術(shù)后生存時間的獨立因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響生存時間的多因素分析

3 討論

腫瘤的異質(zhì)性會干擾生物標志物評估的可重復性。因此，必須全面評估候選生物標志物的價值以確認其有效性。本研究中，筆者分析了100 例OSCC患者及相對應的正?？谇火つそM織中ORAOV1 蛋白的表達，并對臨床病理特征進行了比較。筆者發(fā)現(xiàn)OSCC 組織中ORAOV1 蛋白的陽性表達率高于其在對照組織中的陽性率。此外，其陽性率與OSCC 浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關。筆者的結(jié)果與之前的研究相似，表明ORAOV1 的過表達應該促進OSCC 浸潤轉(zhuǎn)移[4，9]。

CD133 是人類造血干細胞的細胞表面生物標志物，存在于各種癌癥組織中[4]。在OSCC 中，已經(jīng)證明CD133 與腫瘤的侵襲進展相關，并顯示可預測抗癌治療的不良預后[10]。在本研究中，CD133 其陽性率與OSCC 浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關。此外，Kaplan-Meier 生存分析顯示，CD133 陽性表達患者的OS 與陰性表達的患者相比，生存時間顯著降低。以上結(jié)果表明CD133 的過表達可能參與了OSCC 細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，預后較差。筆者結(jié)果與之前的研究一致，包括口腔癌和其他癌癥的研究[4，10-13]。

KiSS-1 被廣泛認為是多種癌癥轉(zhuǎn)移的抑制基因[7，14-16]。KiSS-1 可以抑制癌細胞增殖、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。本研究結(jié)果還表明，OSCC 組織中KiSS-1 的陽性表達率低于其在對照正常組織中的陽性率，其陽性率還與OSCC 浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期有關。此外，Kaplan-Meier 生存分析KiSS-1 表達陽性患者的OS 時間長于陰性患者。上述結(jié)果表明KiSS-1 的下調(diào)或失控應被視為預測OSCC 患者轉(zhuǎn)移和預后的潛在生物標志物，這與之前的研究一致[7，14-20]。

TNM 分期為臨床治療OSCC 提供策略，但并不能描述OSCC 生物學行為的詳盡信息。因此，迫切需要尋找新穎有效的候選生物標志物來預測OSCC 的生物學行為、轉(zhuǎn)移和患者預后。本研究多因素分析表明，ORAOV1 和CD133 蛋白的高表達及KiSS-1 蛋白的低表達可能是影響OSCC 患者術(shù)后生存時間的獨立因素。以上結(jié)果表明ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的表達可能在一定程度上預測OSCC 的轉(zhuǎn)移和預后方面有重要意義。

OSCC 是主要的常見口腔癌類型。CD133 表達異常增高可能通過促進腫瘤干細胞的增生，而參與OSCC 的腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)過程[18]。腫瘤干細胞的自我更新和多分化能力促進OSCC 細胞快速生長。同時，ORAOV1 的過表達也通過激活一系列細胞周期蛋白促進癌細胞增殖和侵襲而促進腫瘤發(fā)生。它還參與血管生成以促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。事實上，腫瘤干細胞所在的微環(huán)境主要由微血管或微淋巴管組成。因此，這些微血管支持進一步促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。KiSS-1 通過促進E-cadherin 表達和抑制可降解細胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶表達來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，KiSS-1 的下調(diào)或丟失調(diào)節(jié)可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ORAOV1、CD133 和KiSS-1 會影響OSCC 浸潤進 展；ORAOV1、CD133 和KiSS-1 的聯(lián)合檢測可以在一定程度上預測OSCC 患者浸潤和轉(zhuǎn)移。