甘蔗花葉病毒四川分離物的鑒定和遺傳變異分析

李明駿， 鐘源， 廖豪杰， 吳根土， 青玲

西南大學 植物保護學院/植物病害生物學高校市級重點實驗室,重慶 400716

玉米(ZeamaysL.)是我國廣泛種植的糧飼作物,也是重要的生物能源和工業原料,在我國農業生產中占據重要地位[1].隨著我國種植結構的調整和氣候變暖導致的媒介昆蟲大面積遷飛和分布,玉米矮花葉病、 玉米粗縮病、 玉米致死性壞死病等病毒病害在我國一些玉米種植區間歇性大面積發生.目前在我國玉米上已檢測出甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus,SCMV)、 水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)、 玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV)、 玉米黃花葉病毒(maize yellow mosaic virus,MaYMV)、 留尼旺玉米線條病毒(maize streak Reunion virus,MSRV)等12種病毒,嚴重威脅著我國玉米的生產[2].甘蔗(SaccharumofficinariumL.)在四川、 云南、 廣東和福建等地區廣泛種植,是我國最重要的糖料作物,也是生產葡萄糖、 乙醇等產品的重要原料.甘蔗上的常發病毒病主要包括SCMV、 高粱花葉病毒(sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗線條花葉病毒(sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)引起的甘蔗花葉病,甘蔗黃葉病毒(sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的甘蔗黃葉病,以及甘蔗線條病毒(sugarcane streak virus,SSV)、 甘蔗斐濟病病毒(sugarcane Fiji disease virus,SFDV)和甘蔗桿狀病毒(sugarcane bacilliform virus,SCBV)等引起的病毒病[3]．

SCMV在我國廣泛分布,其引起的玉米矮花葉病和甘蔗花葉病是我國玉米和甘蔗上的兩種重要病毒病害[4-5].SCMV是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員,經由玉米蚜、 麥二叉蚜等多種蚜蟲以非持久性方式進行傳播,是侵染玉米、 高粱、 甘蔗等禾本科植物的重要病毒病原[6-8].SCMV侵染可誘導花葉、 褪綠和矮化等多種癥狀,最終造成嚴重的產量損失[9-10].SCMV為線狀病毒粒體,包裹1條長約10 000堿基且3′末端有poly(A)結構的正單鏈RNA基因組[11].SCMV基因組編碼1個大的多聚蛋白,隨后被切割為10個成熟蛋白以及轉錄滑移所產生的P3N-PIPO蛋白[12].馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼的外殼蛋白(CP)是一個多功能蛋白,參與病毒基因組的包被、 病毒移動、 蚜蟲傳播等生物學過程[13-14].因為外殼蛋白基因功能和序列的保守性,通常被用于病毒分類和病毒變異、 重組等遺傳進化研究[8，15]．

病毒檢測和病毒群體的遺傳變異分析有利于了解病毒的地理分布和寄主適應性,且有益于對病毒病流行趨勢進行評估,是病毒病害防控的重要手段[16-18].玉米是我國西南地區廣泛種植的重要糧飼作物,甘蔗是四川和云南部分地區種植的重要經濟作物,但病毒病的發生嚴重威脅著玉米和甘蔗的生產.基于本課題組前期對四川玉米和甘蔗病毒病田間調查結果,本研究從四川攀枝花市采集共計54份表現花葉、 斑駁、 矮化等癥狀的玉米病葉和42份甘蔗病葉,以小RNA高通量測序結合反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法對玉米和甘蔗病樣中的病毒種類和發生率進行檢測； 并擴增獲得四川玉米上6個和甘蔗上5個SCMV分離物的CP基因序列,綜合NCBI數據庫中的SCMV所有中國分離物CP基因序列分析SCMV四川分離物群體的遺傳變異情況．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒源

分別于2019年7月和2020年8月從四川攀枝花田間采集表現花葉、 褪綠、 斑駁、 矮化等癥狀的玉米病葉樣品54份和甘蔗病葉42份,保存于-80 ℃冰箱中．

1.1.2 載體和菌株

克隆載體pMDTM19-T,日本TaKaRa公司； 大腸桿菌EscherichiacoliTrans5α,北京全式金生物技術有限公司．

1.1.3 主要試劑

Ex Taq?DNA聚合酶,RNAiso Plus總RNA提取試劑,M-MLV反轉錄試劑盒,T4 DNA連接酶,日本TaKaRa公司； 通用型DNA純化回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司．

1.1.4 引物

本研究中所用引物序列信息見表1,SCMV檢測引物引自文獻[19],其他檢測引物和SCMVCP基因擴增引物根據GenBank中多個病毒分離物基因組序列多重比對分析后在序列保守區設計．

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及RT-PCR

取玉米或甘蔗病葉約0.1 g,充分研磨后用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑參照說明書流程提取總RNA,-80 ℃冰箱中保存備用．

以提取的總RNA為模板,用TaKaRa公司的M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA.反應體系(10 μL)： 總RNA 1 μg,Oligo(dT) Primer (50 μmol/L) 1 μL,Random Primers (25 μmol/L) 1 μL,RNase-free ddH2O補至6 μL； 于70 ℃水浴孵育10 min后冰上冷卻2 min； 向上述溶液中依次加入5×M-MLV buffer 2 μL,10 mmol/L dNTP混合物0.5 μL,40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL,200 U/μL M-MLV反轉錄酶0.5 μL,RNase-free ddH2O補至10 μL； 42 ℃保溫1 h.反應獲得cDNA產物直接用于PCR擴增或于-20 ℃冰箱中保存備用．

以反轉錄獲得cDNA為模板進行PCR擴增,病毒檢測PCR反應體系(25 μL)： ddH2O 11.0 μL,cDNA 0.5 μL,10 μmol/L上下游引物各0.5 μL,PCR mix 12.5 μL.SCMVCP基因克隆的PCR反應體系(50 μL)： ddH2O 37.5 μL,10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)5.0 μL,dNTPs 4.0 μL,cDNA 1.0 μL,10 μmol/L上下游引物各1.0 μL,Ex Taq 0.5 μL.PCR反應程序設定： 94 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性30 s后退火30 s(退火溫度根據引物熔解溫度確定),72 ℃延伸 30～60 s(根據擴增片段長度確定),34次循環； 最后72 ℃延伸10 min.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析．

1.2.2 DNA純化回收、 連接T載體及轉化大腸桿菌

PCR產物用天根通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit,TIANGEN)參照說明書流程純化回收.回收產物連入pMDTM19-T 載體,連接反應體系(10 μL)： 10×T4 DNA Ligase buffer 1 μL,回收產物5 μL,pMDTM19-T 0.5 μL,T4 DNA Ligase 0.5 μL,ddH2O補至10 μL,置于16 ℃過夜反應.將連接產物轉化大腸桿菌Trans5α感受態,37 ℃培養后挑取單菌落在含抗生素(100 mg/L氨芐青霉素)LB液體培養基中培養6～8 h,菌液經PCR檢測后選陽性克隆進行測序分析．

1.2.3 序列測定及生物信息學分析

經PCR檢測呈陽性的菌液委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫用BLAST進行序列相似性檢索.用本研究中克隆獲得SCMV四川分離物CP基因和NCBI數據庫中已上傳的所有SCMV中國分離物CP基因序列進行系統進化分析,以玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV)CP基因為外組,用MEGA4軟件的鄰接(Neighbor-Joining)法構建系統進化樹,重復取樣1 000次[20].SCMV核苷酸變異、 群體分化和基因流、 群體中性測試均用DNaSP軟件進行分析[21]．

2 結果與分析

2.1 四川玉米和甘蔗病樣中的病毒檢測

從四川攀枝花田間采集表現病毒病癥狀的玉米和甘蔗植株病葉,玉米葉片主要表現褪綠、 斑駁和花葉癥狀,甘蔗葉片主要表現褪綠、 黃化、 壞死和葉卷曲癥狀(圖1)．

為綜合分析所采集樣品中存在的病毒種類,各樣品均取0.1 g混合研磨制備混樣并提取總RNA,委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行小RNA高通量測序.測序共獲得13 868 023個reads,去除接頭以及長度小于18或大于32個核苷酸的reads,獲得9 505 185個Clean reads.將Clean reads通過從頭組裝產生重疊群后與病毒數據庫GenBank Virus RefSeq進行比對并注釋得到的病毒序列.所有重疊群共比對到5種病毒： SrMV,MaYMV,SCMV,SCBGAV和MSRV(表2)．

PZH1,PZH2,PZH7,PZH8為本研究中樣品編號．圖1 四川攀枝花田間部分玉米和甘蔗病樣癥狀

表2 小RNA高通量測序鑒定玉米和甘蔗樣品中的病毒種類

為驗證玉米和甘蔗樣品中存在的病毒種類,分別提取本研究中采集的54份玉米和42份甘蔗樣品總RNA,反轉錄合成cDNA,以表1中引物分別進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明： 四川攀枝花玉米病樣中可檢出SCMV,MaYMV和MSRV 3種病毒,檢出率分別為66.7%,59.3%和3.7%； 甘蔗病樣中可檢出SCBGAV,SCMV和SrMV 3種病毒,檢出率分別為76.2%,52.4%和28.6%(表3).從每種病毒的陽性樣品中隨機選取2個PCR擴增產物經切膠回收后連入pMDTM19-T載體,轉化大腸桿菌Trans5α感受態,挑取陽性克隆進行序列測定,序列分析顯示擴增產物均為對應病毒基因組序列,表明擴增出目標片段的玉米或甘蔗樣品被該病毒侵染．

表3 四川攀枝花玉米和甘蔗樣品中病毒種類和侵染率的RT-PCR檢測結果

2.2 SCMV四川分離物CP基因克隆及遺傳變異分析

目前GenBank數據庫中尚無SCMV四川分離物的基因序列,本研究隨機選取6個檢出SCMV的玉米和5個檢出SCMV的甘蔗樣品cDNA為模板,以引物對SCMV-CP-F/SCMV-CP-R擴增CP基因全序列.擴增產物經純化回收后連入pMDTM19-T載體并轉化大腸桿菌Trans5α感受態,每個轉化子挑取3個陽性克隆經測序鑒定SCMVCP基因序列(表4)．

表4 克隆CP基因序列的SCMV分離物

為綜合分析SCMV四川分離物群體在SCMV中國分離物群體中的遺傳進化,利用從四川玉米和甘蔗上擴增獲得的SCMV分離物CP基因序列,并從GenBank數據庫中下載獲得所有來源于我國不同地區及寄主的SCMVCP基因序列,構建系統進化樹并分析其遺傳變異情況.序列比對結果顯示,120個SCMV中國分離物的CP基因序列的核苷酸同源性為73.8%～100.0%.以MEGA4軟件構建系統進化樹,結果顯示,所有SCMV中國分離物聚為5個進化組分支(圖2)．

圖2 基于SCMV中國分離物CP基因序列的系統進化樹

A組和C組中SCMV分離物主要來自玉米,而B組和D組分離物則主要來自甘蔗.來自于玉米的SCMV四川分離物PZH1,PZH3,PZH4和PZH6位于C組,而來自于甘蔗的SCMV四川分離物PZH7,PZH8,PZH9,PZH10和PZH11均位于E組,表明SCMV的遺傳進化具有明顯的寄主特異性.進化樹聚類結果還表明,來自于四川和云南甘蔗上的SCMV分離物主要聚于E組,來自于福建和浙江甘蔗上的SCMV分離物分別聚于D組和B組,來自于四川、 山西、 陜西、 河北和山東幾個地域依次毗鄰省份玉米上的SCMV分離物同聚于C組,即來自于同種寄主、 同一省份或鄰近省份的SCMV分離物可聚為同一組,這說明地理起源對于SCMV的遺傳進化也具有重要作用．

以DnaSP5軟件計算SCMV中國分離物群體的核苷酸多樣性為0.129 88,表明SCMV中國分離物群體的總體變異度較低.對SCMV分離物序列信息超過10個的四川、 云南、 河北、 山西、 陜西、 山東等地的SCMV分離物CP基因的核苷酸多樣性進行分析,結果表明,來源于河北、 山西和陜西3省的SCMV分離物核苷酸變異度更低,且均來自于各省相同的宿主.而來源于四川、 云南和山東的SCMV分離物來自于至少兩種以上的宿主,且各省SCMV群體的核酸變異度也相對更高(表5).該結果與對SCMV系統進化的分析一致,均可表明宿主在SCMV中國分離物的遺傳分化過程中發揮著重要的作用．

表5 SCMV群體CP基因核苷酸多樣性分析

基于上述結果分析,宿主和地理分布在SCMV中國分離物的遺傳進化過程中作用明顯,且SCMV在田間主要由蚜蟲進行傳播,暗示著鄰近地理區域的SCMV群體可能因蚜蟲的交叉傳播出現趨同進化.本研究以DnaSP5軟件分析了四川與云南、 山西、 陜西、 河北和山東等省SCMV分離物群體間的遺傳分化和基因流,種群間的遺傳分化程度采用Ks*,Z和Snn 3個參數來反映,種群間的基因流采用FST值來反映[16,21-22].FST測試結果表明,SCMV四川和云南分離物之間的FST值(表示不同群體間的遺傳多樣性,反映基因流遷移率)為0.011 23,而四川與其他省份分離物群體間的FST值均大于0.33,表明四川和云南的SCMV分離物群體間基因流更為頻繁(表6).本研究中的SCMV四川分離物來源于四川最南端川滇結合部的攀枝花市,與云南相鄰,這表明更近的地理分布更易導致相鄰地區SCMV 群體的頻繁基因流．

表6 四川與其他地理區域SCMV群體的遺傳差異和基因流

SCMV四川和云南分離物間的頻繁基因流暗示這兩個區域間的SCMV可能以某種方式(如蚜蟲的田間傳播)進行著交叉傳播.根據SCMV中國分離物CP基因系統進化樹分組結果,SCMV四川和云南分離物均主要聚于C組和E組.為分析C組和E組的SCMV四川和云南分離物種群(分別表示為SC-YN-GpC和SC-YN-GpE)的擴展態勢,本研究通過Tajima’sD,Fu and Li’sD和Fu and Li’sF等方法進行中性測試[23-24].結果顯示,來自于C組和E組的四川和云南分離物群體的Tajima’sD,Fu and Li’sD和Fu and Li’sF值均為負值,但未達到統計學意義,表明SC-YN-GpC和SC-YN-GpE兩個種群在四川和云南可能存在擴張趨勢(表7)．

表7 SCMV四川和云南分離物群體變異中性測試

3 結論與討論

本研究是對四川攀枝花玉米和甘蔗中病毒病原種類和侵染率的綜合分析,也是對SCMV四川分離物群體遺傳變異情況的首次報道.我國玉米和甘蔗上的病毒病害長期發生,隨著病毒鑒定技術的發展,目前我國已在田間玉米和甘蔗上鑒定到多種病毒[2-3，25-26].本研究從四川攀枝花市玉米上檢出SCMV,MaYMV和MSRV 3種病毒,從甘蔗上檢出SCBGAV,SCMV和SrMV 3種病毒,其中SCMV是引起該地區玉米和甘蔗病毒病的重要病原．

前期研究對世界上某些地區SCMV分離物的遺傳進化分析結果暗示宿主和地理因素對SCMV進化的重要性[16，27].本研究對中國不同省區SCMV分離物群體的遺傳進化分析結果顯示,SCMV中國分離物可聚為5個進化分支,且其系統進化和核苷酸多樣性分析結果均表明,宿主和地理起源在SCMV的遺傳進化過程中發揮著重要的作用.FST測試表明來源于川滇交界處的四川攀枝花SCMV分離物和云南分離物間存在頻繁基因流,這也表明地理因素在SCMV遺傳進化過程中同樣作用明顯,這可能與蚜蟲在較近的地理距離內頻繁交叉傳播SCMV有關.本研究中兩個來源于玉米的分離物PZH2,PZH5和來源于四川甘蔗的5個分離物聚入同一組,這可能也是由于蚜蟲在玉米和甘蔗間交叉傳播SCMV所導致．