連術消渴顆粒對2 型糖尿病模型大鼠血清炎癥狀態、肝臟脂代謝、氧化應激及病理變化的影響

吉蘭潔 李鵬輝 張芳 顧娟娟 付永祥 王銀姍 盧昭 金凱 李慧敏 閆鏞

2 型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是常見的慢性病之一。 T2DM 動物模型是研究糖尿病發病機制和臨床防治的基礎,高脂飲食聯合鏈脲佐菌素建立動物模型是一種常見的造模方法,該模型適應于研究T2DM 發病機制及評價藥物降糖效果等實驗[1]。中醫治療T2DM 注重整體調節、辨證論治、綜合調理,以達到陰陽平衡、氣血調和、氣機調暢、臟腑協調、清升濁降、在平穩調糖的基礎上,還具有緩解癥狀的優勢[2],同時中藥通過保護胰島β 細胞及增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,改善機體氧化應激水平等途徑發揮防治糖尿病的作用[3]。 連術消渴顆粒以運脾清熱、泄濁祛瘀為治則,在臨床上常用于改善T2DM 血糖、血脂、胰島素抵抗等。 本研究通過觀察連術消渴顆粒對T2DM 模型大鼠血清炎癥水平、肝臟脂代謝、氧化應激及肝臟病理變化的影響,為進一步研究連術消渴顆粒在T2DM 中的具體作用機制奠定基礎。 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 雄性大鼠,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,體質量200 ~ 220 g,動物合格證號1107261911004137; 生產許可證號 SCXK (魯)20190003;實驗室使用許可證編號SYXK(豫)2015-0005,于22 ℃、50%濕度條件下實驗室飼養后隨機分組。

1.2 實驗試劑與儀器

連術消渴顆粒(成人每日34.98 g)為中藥配方顆粒,相當于含黃連30 g、炒蒼術12 g、炒枳實10 g、升麻 10 g、陳皮12 g、姜半夏 10 g、山楂 30 g、神曲10 g、澤瀉 30 g、茯苓 15 g、僵蠶 10 g、水蛭 3 g、干姜10 g、大棗10 g、甘草6 g,由廣東一方制藥有限公司統一提供,批號:20190807。 鹽酸二甲雙胍片產自中美上海施貴寶制藥有限公司,批號:H20023370。

檸檬酸(天津市致遠化學試劑有限公司,批號:2017508);檸檬酸鈉(天津市致遠化學試劑有限公司,批號:2017402);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ) (上海麥克林生化科技有限公司,批號:CI0584849);甲醛溶液(西隴科學股份有限公司,批號:1901232);大鼠血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肝組織勻漿中甘油 三 酯 (triglyceride, TG)、 總 膽 固 醇 ( total cholesterol,TC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、 丙 二 醛 ( malondialdehyde,MDA)的ELISA 檢測試劑盒均為96T,批號分別為:E20200608A、E20201022A、E20201021A、E20201124A、E20201123A、E20201218A、E20201028A、E20201123A,均產自蘇州卡爾文生物科技有限公司。

血糖儀[江蘇魚躍醫療設備股份有限公司,Ⅱ型(730)];血糖試紙(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司,190311);電子秤(廣東香山衡器集團股份有限公司,EK813);電子天平[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司,AL204];高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司,KDC-160HR);可調式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司,DHG-9038A);洗板機(美國伯騰儀器有限公司,50TS8);酶標儀(美國BIO-RAD 公司,680 型);電泳儀(美國BIO-RAD 公司,mini protean 3 cell)。

1.3 造模、分組及給藥

72 只成年健康SD 雄性大鼠,于實驗室適應性飼養3 天后,隨機分為連術消渴顆粒高劑量組、連術消渴顆粒中劑量組、連術消渴顆粒低劑量組、二甲雙胍組、模型組及空白組,每組12 只。 空白組給予正常飼養;其余各組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(基礎飼料+1.5%膽固醇+10%蛋黃粉+10%豬油+0.25%膽鹽+5%蔗糖),飼養30 天后大鼠禁食12 小時,腹腔注射STZ45 mg/kg(0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液,pH 4.2),空白組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。 1 周后,于大鼠尾部少量取血,T2DM 成模標準為:空腹血糖≥11.1 mmol/L, 隨機血糖≥16.7 mmol/L[4]。 連術消渴顆粒高、中、低劑量組大鼠分別給予 11.68、5.84、2.92 g/(kg·d)連術消渴顆粒灌胃,鹽酸二甲雙胍組大鼠給予0.17 g/(kg·d)鹽酸二甲雙胍片灌胃,空白組及模型組給予相同劑量的純凈水灌胃。 各組大鼠均每日給藥1 次,連續給藥30 天。 于每10 天稱體質量1次,根據大鼠體質量變化調整用藥量。

1.4 血清炎癥因子相關指標檢測

末次給藥后禁食不禁水12 小時,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,經腹主動脈采血,并取出完整肝臟。 留取血清,測定血清中 NO、NOS、TNF-α、SOD水平,所有操作嚴格按照相應試劑盒的說明書進行。

1.5 脂代謝及氧化應激相關指標檢測

取一定量肝臟組織,剪碎,以無菌生理鹽水研磨為10%的組織勻漿,測定其中 TG、TC、GSH-Px、MDA 含量。

1.6 肝組織形態觀察

取部分肝組織以多聚甲醛浸泡固定24 小時,按步驟脫水,包埋,切片,HE 染色,封固。 顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織形態。

1.7 統計學方法

使用SPSS19.0 進行統計學處理,計量資料符合正態分布,方差齊,結果以平均值±標準差()表示,多組間比較用單因素方差分析,病理半定量分析采用Ridit 檢驗,以P<0.05 為具有統計學意義,以P<0.01 為統計學意義顯著。

2 結果

2.1 連術消渴顆粒對STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型血清 NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較

與空白組相比,模型組大鼠血清中NO、NOS、TNF-α水平顯著升高(P<0.01),SOD 水平顯著降低(P<0.01)。 與模型組比,二甲雙胍組和連術消渴顆粒高劑量組可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平顯著降低(P<0.01),SOD 水平顯著升高(P<0.01);連術消渴顆粒中劑量組可使大鼠血清NO 水平降低(P<0.05),血清 NOS、TNF-α 水平顯著降低(P<0.01),SOD 水平顯著升高(P<0.01);連術消渴顆粒低劑量組可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平降低(P<0.05),SOD 水平升高(P<0.05)。 結果詳見表1。

表1 各組大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較()

表1 各組大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較()

注: 與空白組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 劑量(g/kg) NO(μmol/L) NOS(μmol/L) TNF-α(pg/mL) SOD(U/mL)94±8.79模型組 12 - 26.38±3.12a 30.04±1.58a 231.26±24.40a 134.63±6.78a二甲雙胍組 12 0.17 22.47±2.51c 26.68±2.15c 190.13±14.14c 149.40±5.47c連術消渴顆粒高劑量 12 11.68 22.89±2.68c 27.09±1.91c 191.81±21.11c 146.47±7.38c連術消渴顆粒中劑量 12 5.84 23.16±2.74b 27.57±1.9c 199.48±13.99c 145.38±9.08c連術消渴顆粒低劑量 12 2.92 23.36±2.54b 27.94±2.36b 212.72±13.35b 142.06±8.34空白組 12 - 21.29±2.74 25.99±1.39 169.30±17.84 155.b

2.2 連術消渴顆粒對STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝臟脂代謝、氧化應激指標比較

與空白組比,模型組大鼠肝組織勻漿TG、TC、MDA 水平顯著升高(P<0.01),GSH-Px 水平顯著下降(P<0.01)。 與模型組比,連術消渴顆粒高、中劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織勻漿TG、TC、MDA 水平顯著降低(P<0.01),GSH-Px 活性顯著升高(P<0.01);連術消渴顆粒低劑量組大鼠肝組織勻漿TC 水平顯著降低(P<0.01),TG、MDA 水平下降(P<0.05),GSH-Px 水平顯著升高(P<0.01)。 結果詳見表2。

表2 各組大鼠肝組織勻漿TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比較()

表2 各組大鼠肝組織勻漿TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比較()

注: 與空白組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 劑量(g/kg) TG(mmol/L) TC(mmol/L) GSH-Px(U/L) MDA(nmol/mL).43模型組 12 - 1.53±0.15a 6.35±0.97a 98.88±10.40a 8.04±0.55a二甲雙胍組 12 0.17 1.28±0.11c 5.14±0.37c 105.10±7.01c 7.25±0.42c連術消渴顆粒高劑量 12 11.68 1.32±0.71c 5.29±0.21c 106.34±11.56c 7.35±0.52c連術消渴顆粒中劑量 12 5.84 1.35±0.73c 5.40±0.25c 107.40±8.08c 7.50±0.27c連術消渴顆粒低劑量 12 2.92 1.41±0.67b 5.59±0.41c 111.56±10.64c 7.67±0.23空白組 12 - 1.22±0.88 4.93±0.28 121.47±10.32 7.17±0 b

2.3 連術消渴顆粒對STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝臟組織形態比較

經Ridit 檢驗,與空白組相比,模型組大鼠肝組織病理變化顯著(P<0.01),肝小葉結構散亂,肝細胞凝固性壞死、重度水腫,肝細胞索和肝竇排列無規律不規則。 與模型組相比,連術消渴顆粒高劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織病理變化顯著改善(P<0.01),連術消渴顆粒中劑量組大鼠肝臟病理變化有改善(P<0.05),連術消渴顆粒低劑量組大鼠肝臟病理變化有改善的趨勢,差異無統計學意義(P>0.05)。 結果詳見表 3 及圖 1。

圖1 各組大鼠肝組織形態比較(HE 染色,×20)

表3 各組大鼠肝組織病理變化比較

3 討論

現代醫學的“糖尿病”常歸于中醫學“消渴病”范疇。 研究發現,濕熱互結證已成為當代T2DM 常見的主要證型之一,同時糖尿病體質類型中濕熱質尤為常見[5-7]。 “痰、熱、瘀、毒”,為 T2DM 發生發展的重要病機之一[8],且“炎癥”“氧化應激”的發生機理與中醫學“毒”邪理論亦有密切相關性[9],具有祛濕、清熱、解毒作用的中藥及復方均可抑制炎癥[10]。課題組結合T2DM 發病特點,總結認為飲食不節,脾失健運,濕熱互結是其主要病機之一,其中脾失健運為其始動因素,濕熱耗傷氣陰是T2DM 發病的內在因素,瘀血貫穿于疾病始終,據證立法,以法組方,提出運脾清熱,泄濁祛瘀的主要治則,創制連術消渴方。 方中黃連、蒼術共為君藥,以順應脾性,燥濕運脾。 升麻、枳實相伍,一升一降,以助脾運。 陳皮、姜半夏、茯苓、澤瀉四味合用,使濕無所聚,痰無由生;山楂、神曲運脾開胃,通利血脈;僵蠶、水蛭合用以攻積久之滯,以上諸藥共為臣藥。 干姜溫護中焦,以為佐藥,大棗健脾益氣、甘草補脾和中,用以為使。 全方標本兼顧,使脾運、濁化、瘀消,則氣機調達,三焦、經絡通暢,消渴自已。 前期臨床研究顯示,連術消渴顆?？捎行Ы档蚑2DM(痰熱互結型)患者血糖、血脂水平,改善其臨床癥狀及體征,改善胰島素抵抗狀態[11-14]。 實驗研究顯示,連術消渴顆?？梢越档蚑2DM 模型大鼠的空腹血糖及糖基化血清蛋白水平、改善大鼠飲食量、飲水量、體重等表觀指標[15],修復并保護其腸黏膜屏障功能,促進結腸水通道蛋白的表達[16],可見該方對T2DM 具有一定的防治作用。

血清TNF-α 常作為評價機體炎癥狀態的重要指標,可誘導胰島細胞損傷[17]。 SOD、GSH-Px 是機體抗氧化系統中重要的抗氧化酶[18],能夠清除過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),保持細胞氧化還原處于平衡狀態。 NO、NOS 與機體氧化應激關系密切,在T2DM 發展中發揮重要作用[19]。 NOS 在高糖狀態下過度表達,從而生成大量的 NO,損傷機體[20]。 MDA 是脂質過氧化裂解生成的最終產物[21],常作為反映氧化應激的關鍵生物標志物之一,T2DM 體內MDA 水平可能高于正常者,其濃度與細胞損傷程度相關[22]。

本研究結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝組織勻漿 TG、TC、MDA水平顯著升高,血清SOD 水平及肝組織勻漿GSH-Px水平顯著降低,且肝臟組織形態顯示肝小葉結構散亂,肝細胞凝固性壞死、重度水腫,肝細胞索及肝竇排列無規律不規則,病理變化顯著(均P<0.01),這與現代研究結果一致。 現代研究表明,T2DM 者體內胰島素抵抗狀態常不同程度減弱機體調節脂肪代謝的能力,對脂肪的分解代謝產生抑制作用,使肝細胞內出現脂肪堆積[23],久而形成脂肪肝,肝臟抗氧化能力降低;胰島素抵抗又可促使外周脂肪動員增強,使血中游離脂肪酸生成增多,產生炎癥及氧化應激狀態[24]。 T2DM 機體胰島素抵抗狀態與炎癥及氧化應激狀態長期共存[25],且關系密切。

本研究結果中,各劑量組連術消渴顆粒均能降低 T2DM 模型大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝組織勻漿中 TG、TC、MDA 水平,升高血清 SOD 及肝組織勻漿GSH-PX 水平,與模型組比,連術消渴顆粒高劑量組可使大鼠肝臟病理變化顯著改善(P<0.01),連術消渴顆粒中劑量組可使大鼠肝臟病理變化改善(P<0.05),連術消渴顆粒低劑量組大鼠肝臟病理變化有改善的趨勢(P>0.05)。 可見連術消渴顆粒具有調節T2DM 模型大鼠脂代謝,改善炎癥狀態、氧化應激反應的作用,且可改善大鼠肝臟組織病理。

綜上所述,連術消渴顆粒能夠有效降低T2DM大鼠肝組織勻漿TG、TC 水平,起到降糖調脂的作用,其機制可能與降低炎癥因子水平、改善機體氧化應激狀態及肝臟病理變化相關,為臨證防治T2DM提供了依據。 但該方作用途徑尚未明確,有待進一步研究,以期充分闡明連術消渴顆粒具體作用機制。