淫羊藿甙改善骨髓充質干細胞在防治股骨頭上無菌化壞死作用的機制研究

仇志強，廖琦，蔡風，周斌，王萌

（南昌大學第二附屬醫院骨科，南昌 330000）

非創傷無菌性股骨頭壞死可以導致髖關節疼 痛不適，最后股骨頭發生塌陷，進一步可能需要行全髖關節置換術[1]。現在研究又認為股骨頭無菌性壞死是一種骨細胞或者間充質干細胞的疾病。股骨頭壞死患者骨髓造血及間室中的間充質干細胞的數量及活力都大為下降[2]。因此有了大量骨髓間充質干細胞移植治療骨壞死的研究，但是對于其療效尚存在爭議。淫羊藿是傳統的補腎壯陽中草藥，其主要化學成分是黃酮、苷和多糖。有研究表明，淫羊藿總黃酮具有防治切除卵巢大鼠發生骨質疏松癥的作用[3]，而單體成分淫羊藿苷不僅促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，還抑制其分化為破骨細胞和抑制其骨吸收活性[4]。但它對骨壞死微環境中的骨髓間充質干細胞增殖與成骨分化的影響如何，國內外尚無報道。本實驗以加入了壞死骨培養液的條件培養基來模擬體內骨壞死微環境，探討骨壞死微環境對外源性骨髓間充質干細胞的影響及淫羊藿苷在骨壞死微環境中對骨髓間充質干細胞增殖與成骨分化的影響，佐證淫羊藿苷可以增強BMSCs治療股骨頭無菌性壞死的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器12月齡清潔級健康雜種犬4只，雌雄不限，體重15~20 kg，由南昌大學第二附屬醫院動物實驗室提供。L-DMEM培養基、胎牛血清、PBS（GIBCO公司，美國）；犬單核細胞分離液（嘉美生物技術公司）ALP檢測試劑盒、ALP染液（南京建成生物工程研究所）；MTT試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；淫羊藿苷標準品（純度＞98%，北京華邁科生物技術公司）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素C（Sigma公司，德國）；茜素紅（北京索萊寶科技公司）恒溫CO2培養箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺（北京長城空氣凈化公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Thermo公司 美國）

1.2 犬BMSCs的分離、培養 對試驗狗進行速眠新II(0.04～0.08 mL/kg)肌肉注射全身麻醉，以髂后上棘為穿刺點，抽取骨髓約10 mL。與PBS緩沖液1∶1混勻后，小心加于20 mL的狗單核細胞分離液（1.077 g／mL）的液面上，以2500 r/min離心30分鐘，此時離心管中由上至下細胞分四層，收集乳白色的單個核細胞層細胞，反復PBS洗滌、離心后得狗骨髓單個核細胞，接種于含完全培養基(LDMEM、10%FBS、100 U/mL青、鏈霉素)的75 cm2培養瓶，置37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱內培養。每2～3 d全量換液1次，去除未貼壁成分。細胞80%融合時，傳代培養。

1.3 壞死骨的培養及培養液的收集 對試驗狗進行全身麻醉后固定于手術臺上。參照童培建[5]等人的實驗方法以液氮冷凍建立股骨頭壞死模型。造模后2周處死實驗狗，無菌條件下取出壞死的股骨頭，去除周圍軟組織及外層軟骨，將股骨頭切成大小合適的小骨塊，置于含完全培養基的培養皿中培養，同時行病理切塊證實股骨頭已壞死。每3 d全量換液1次，收集壞死骨培養液，2500 r/min離心30 min去除其中的細胞及雜質，過濾除菌后分裝，-20℃冰箱冷藏。

1.4 細胞增殖分析P2代細胞以2×104cell／mL接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后更換含2.58、4.18、6.77、10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷的條件培養基(L-DMEM、10%FBS、5%壞死骨培養液、100 U/mL青、鏈霉素)。同時設立實驗對照組和標準對照組，實驗對照組更換不含淫羊藿苷的條件培養基，標準對照組更換普通的完全培養基，且對照組都應加入不含淫羊藿苷的載體溶液(DMSO)1 μL／mL，每組平行做6孔。每2~3天換1次培養液，分別于干預后3、6、8天棄培養液，PBS洗2次，換含無血清DMEM后每孔加入10 μL MTT染色液，繼續培養4 h后每孔加入100微升Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀630 nm測定吸光度（OD）值。

1.5 成骨性分化分析P2代細胞以5×104cell／mL接種于6孔板中，每孔1.5 mL。3 d后更換含2.58、4.18、6.77、10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷的成骨誘導培養基(條件培養基、10~8 mol/L地塞米松50 umol/L維生素C 10 mmol/L B-甘油磷酸鈉)。同時設立實驗對照組和標準對照組，實驗對照組更換不含淫羊藿苷的成骨誘導培養基，標準對照組更換不含壞死骨培養液的成骨誘導培養基，同樣對照組都加入不含淫羊藿苷的載體溶液(DMSO)1 μL／mL，每組平行做3孔。每2~3天換1次培養液。

1.5.1 ALP活性測定 于成骨誘導后第7、14 d收集細胞培養液檢測細胞外ALP活性。分別往96孔板中加入待測培養液30 μL，逐一加入緩沖液、基質液各50 μL/孔，37℃水浴30 min，加入顯色劑150 μL/孔，充分混勻后置于酶標儀上測定492 nm處的吸光度(OD)值。為計算培養液中ALP濃度及排除壞死骨培養液本身的干擾，特設立標準孔、空白孔及壞死骨培養液對照孔。各組ALP活性最后以金氏單位/100 mL表示。

1.5.2 ALP細胞染色 于成骨誘導后8 d，利用偶氮偶合法進ALP組織化學染色。棄培養液，PBS洗2遍，滴加固定液固定3 min，固定后滴加底物應用液蓋滿樣本部分，加蓋疏水膜，放置濕盒中，避光37℃孵育15 min，水洗3遍。 趁濕用蘇木素復染3 min左右。水洗，鏡檢。

1.5.3 鈣結節茜素紅染色 于成骨誘導后14天進行鈣結節茜素紅染色。染色方法：細胞用4℃、體積分數為95%乙醇固定1 h，漂洗后加入0.5%茜素紅(Tris-Hcl，pH 8.3)37℃染色30 min，鈣化結節染為紅色。顯微鏡下觀察結果，并使用氯化十六烷基吡啶（Cetylpyridiniumchloride，CPC）對茜素紅染色的礦化結節進行溶解，靜置10 min后，將溶解后的液體按實驗分組收集入96孔板中，上酶標儀，在波長562 nm的設定下測定各孔OD值，收集整理數據進行統計分析。

2 結果

2.1 造模后實驗動物的觀察 術后正常圈養實驗狗，2周后處死實驗狗后可見股骨頭表面光滑，關節液數量及顏色未發現明顯異常，無股骨頭塌陷，股骨頭外形規則。將股骨頭進行X線檢查及病理學檢查證實股骨頭壞死（圖1）。

2.2 犬BMSCs形態學觀察 原代培養細胞接種后見大量比較一致的圓形細胞。8~12 h后開始貼壁，貼壁細胞多呈多角形、橢圓形或梭形。3 d后貼壁細胞呈短梭形或星形(圖2a);6 d時貼壁細胞大部分呈梭形，少部分細胞呈多角形，細胞接觸緊密，部分區域融合成片;10~12 d細胞融合成單層，呈典型細長梭形外觀，集束狀排列(圖2b)。犬BMSCs經成骨誘導后，細胞形態由長梭形逐漸變為多邊形、三角形；胞漿飽滿，繼續培養細胞可復層生長至形成密集的細胞團簇，中心出現細胞基質的沉積，培養皿底部可見白色斑塊礦化結節（圖2c、圖2d）。

2.3 淫羊藿苷在骨壞死微環境中對犬骨髓間充質干細胞增殖的影響 如表1所示，淫羊藿苷可抑制BMSCs的增殖，淫羊藿苷實驗組細胞量均少于實驗對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)；其中干預后第3天17.72 μg/mL組抑制作用最為明顯(P＜0.01)。壞死骨培養液可促進BMSCs的增殖，實驗對照組細胞數量均多于標準對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組犬BMSCs增殖情況比較（±s）

表1 各組犬BMSCs增殖情況比較（±s）

注：與實驗對照組比較ΔP＜0.01；與標準對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 3 d OD630 6 d 8 d 2.58 μg/mL 4.18 μg/mL 6.77 μg/mL 10.95 μg/mL 17.72 μg/mL實驗對照組標準對照組6666666 0.1453±0.0032Δ**0.1483±0.0051Δ**0.1493±0.0351Δ**0.1520±0.0200Δ**0.1270±0.0036Δ**0.1753±0.0152**0.1670±0.0026 0.1687±0.0038Δ 0.1690±0.0061Δ 0.1653±0.0038Δ*0.1757±0.0055Δ 0.1770±0.0020Δ 0.2410±0.0118**0.1787±0.0045 0.2200±0.0132Δ 0.2163±0.0146Δ 0.2180±0.0096Δ 0.2263±0.0153Δ 0.2167±0.0186Δ 0.2683±0.0284*0.2320±0.0223

2.4 淫羊藿苷在骨壞死微環境中對犬骨髓間充質干細胞外ALP活力的影響 犬BMSCs成骨性誘導第7 d，淫羊藿苷實驗組ALP活性均顯著高于對照組，且差異有統計學意義(P＜0.01)；高藥物濃度組較低濃度組ALP分泌較多,而實驗對照組和標準對照組間差異無統計學意義(P=0.598)，見表2。

表2 各組細胞外ALP活性

2.5 淫羊藿苷在骨壞死微環境中對犬骨髓間充質干細胞內ALP的影響 細胞經ALP染色后，細胞核呈藍色，ALP陽性者胞漿中出現紅至紅棕色顆粒，有些為棕褐色或咖啡色顆粒，各組細胞ALP染色均可見陽性表現，其中實驗對照組與標準對照組僅可見彌散的紅色，偶見紅色或咖啡色顆粒（圖3a）；淫羊藿苷實驗組細胞可見有中等量的紅棕色顆粒（圖3b），但各藥物濃度組間鏡下未見明顯差異。

2.6 淫羊藿苷在骨壞死微環境中對犬骨髓間充質干細胞鈣化結節形成的影響 茜素紅染色結果顯示，成骨性誘導14天后，各組細胞聚集樣生長，在聚集生長的中心可見點狀染色陽性的鈣化結節；而淫羊藿苷實驗組形成鈣化結節的作用更強，形成的鈣化結節不但數量多，且面積(團塊狀)也較前兩者大（圖4a、圖4b）；鈣化結節濃度（見圖4c）也顯示淫羊藿苷實驗組鈣結節濃度均多于實驗對照組和標準對照組（P＜0.01），10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷實驗組形成鈣結節的濃度更多。實驗對照組與標準對照組在形成鈣結節濃度上沒有明顯差異。

3 討論

至今為止無菌性股骨頭壞死的發病機理和原因并沒有完全搞清楚。但是，隨著干細胞研究和再生醫學的研究進展發現股骨頭壞死的始動因素可能是細胞起源的，而這也使得細胞療法治療股骨頭壞死成為可能[6-7]。臨床上也出現了許多關于骨髓干細胞移植治療股骨頭壞死的研究，研究表明骨髓干細胞移植對于延緩早期股骨頭壞死的進展及減少壞死區域面積具有一定的作用，但還是有許多患者避免不了最終要出現股骨頭的塌陷[8-9]。為何同種分期的股骨頭壞死患者在進行骨髓干細胞移植后會出現完全相反的結果，骨壞死區域的微環境對植入的骨髓干細胞的影響到底如何，目前還不是很清楚。

本實驗以犬BMSCs為研究對象，利用含有壞死骨培養液的條件培養基在體外模擬骨壞死微環境對BMSCs的影響。研究發現壞死骨培養液可促進BMSCs的增殖，但對其成骨性分化未見明顯影響。說明在BMSCs培養過程中加入壞死骨培養液來模擬骨壞死微環境是可行的，為BMSCs移植治療股骨頭壞死提供了有力支持，但這一發現也和先前Hernigou等[2]人研究發現的激素誘導性股骨頭壞死患者骨髓造血及間室中的間充質干細胞的數量及活力都大為下降這一結果相矛盾。其原因可能是本實驗采用的是液氮冷凍法制作股骨頭壞死模型，在造模后的這段時間機體會合成一系列的可溶性調節因子來修復損傷刺激，其中包括TGF、IL-1、IL-6、花生四烯酸代謝產物前列環素、小分子多肽等，這些分子都具有調節細胞趨化、增殖、分化及生存的功能[10]。當然也有可能是壞死骨在培養過程中分泌了一些其它的促進BMSCs增殖的物質，具體機制如何還有待進一步研究。

淫羊藿苷是傳統中藥淫羊藿的有效藥理成分，近年來已被廣泛用于抗骨質疏松治療和成骨、破骨細胞研究。既往研究表明淫羊藿苷可通過調節成骨細胞中Cbfa1 mRNA和Osterix mRNA的表達及促進成骨細胞形態發生蛋白2的合成等機制，加速成骨細胞的增殖和分化[11-12]。本實驗以骨壞死微環境中培養的犬BMSCs為靶細胞，對淫羊藿苷作為一種骨誘導活性因子的可行性也做了初步研究。結果發現各組濃度的淫羊藿苷在骨壞死微環境中均可抑制BMSCs增殖,且抑制程度與藥物濃度相關,以17.72 μg/mL淫羊藿苷組抑制最為明顯，其余各相鄰藥物濃度組間未見明顯差異。這可能與此次實驗采用了黃金分割原理來實現藥物濃度分組有關，使得各組藥物濃度的作用變化較為緩和，也更容易發現最適藥物濃度[13]。

雖然淫羊藿苷在骨壞死微環境中抑制BMSCs的增殖，但其卻提高了細胞內堿性磷酸酶的表達及細胞外堿性磷酸酶活力。因為堿性磷酸酶是BMSCs的早期成骨分化指標，所以該結果證明淫羊藿苷在骨壞死微環境中同樣具有成骨分化活性。由于增殖和分化是細胞生命活動的兩個方面，增殖中的細胞其分化功能受到抑制，而分化中的細胞其增殖能力降低[14]。因此，考慮淫羊藿苷可能因促進細胞分化而抑制了細胞的增殖效應。淫羊藿苷組和標準對照組在培養后第6 d及第8 d時的細胞數目未見明顯差異也可間接說明此范圍濃度的淫羊藿苷對細胞并無毒性作用。鈣化結節則是成骨細胞功能活動的表現形式，14 d時的茜素紅染色同樣表明，淫羊藿苷在壞死骨微環境中可誘導犬BMSCs向成骨分化，同時還可促進細胞外鈣鹽的沉積，高劑量淫羊藿苷組較低劑量組誘導形成的鈣化結節數量多、面積更大。這也與早期成骨分化時的堿性磷酸酶結果是基本一致的。

綜上所述，本實驗說明骨壞死微環境對BMSCs的增殖是有促進作用的，目前暫未發現其對BMSCs的成骨性分化有明顯影響。而淫羊藿苷在骨壞死微環境中具有抑制BMSCs增殖的作用，同時可以促進BMSCs向成骨細胞分化。如能在細胞基因及蛋白層面來充分研究淫羊藿苷的藥理作用及機制，確定其最適的藥物濃度，那么淫羊藿苷可能成為輔助骨髓干細胞移植治療股骨頭壞死的一種新藥。當然本次試驗尚屬初步研究，以壞死骨培養液模擬骨壞死微環境的可行性及可信度如何還有待進一步研究，是否利用Transwell細胞共培養體系來模擬骨壞死微環境更為可行，這將是下一步研究所努力的方向。