半枝蓮新克羅烷型二萜對人OCI-LY1淋巴瘤細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

劉謙，陳敏，徐芳華，喻友愛，劉勇

（1.江西省人民醫院南昌醫學院第一附屬醫院病理科，南昌 330006；2.南方醫科大學附屬萍鄉醫院病理科，萍鄉 337055）

半枝蓮又名韓信草，馬唇形科黃芩屬多年生草本植物，廣泛分布于我國南方濕地，功效為清熱解毒、化瘀利尿，主治疔瘡腫毒、咽喉腫痛等[1]。據《中華腫瘤治療大成》載，半枝蓮作為抗腫瘤藥物，主治原發性肝癌、胃癌等消化道腫瘤、肺癌及子宮頸癌等[2]。同時，有部分研究將半枝蓮聯合化療用于彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療[3]。現代研究表明，半枝蓮的有效成分中，黃酮、多糖、二萜等具有良好的抗腫瘤活性[4]。近年來在半枝蓮二萜類化合物中，發現部分新克羅烷型二萜具有顯著抗腫瘤活性[5-6]。本研究利用彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞株OCI-LY1作為研究對象，探討半枝蓮新型克羅烷二萜J（SJ）對其增殖、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY1細胞株（上海通派生物科技有限公司），半枝蓮二萜J（江西省人民醫院藥劑科），CCK-8（日本同仁化學，CK04），胎牛血清（Ausbian，VS500T），DMEM（Corning，10-013-CVR），凋 亡 試 劑 盒 （eBioscience，88-8007），PI（Sigma，P4170），RNase A（Fermentas，EN0531），BCR試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，P0010S），cyclin D3（CST公司，1∶500稀釋）。

1.2 儀器 細胞計數儀（Nexcelom Cellometer，Auto 1000），酶標儀（Tecan infinite，M2009PR），流式細胞儀（BD，C6 PLUS），熒光顯微鏡（OLYMPUS，IX71），SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能，VE-180），蛋白轉膜儀（上海天能，VE-186）。

1.3 細胞培養及藥物配制 人彌漫性大B細胞淋巴瘤OCI-LY1細胞培養于10%胎牛血清FBS，于37℃、5% CO2培養箱中培養，2~3天傳代。半枝蓮二萜J用DMSO配制成1 mg/mL，4℃儲存備用。

1.4 CCK-8實驗 將OCI-LY1細胞懸液以每孔2×103個細胞、每孔100 μL接種于96孔板，待細胞沉淀后，用不同質量濃度的半枝蓮二萜J（10、15、20、30、40、60、80、100 μg/mL）處理細胞，同時，設置DMSO作為對照組，作用24、48、72小時；每孔加入10 μL CCK-8，培養2小時后，酶標儀450 nm處測定各孔吸收光度值（A），計算各組細胞活性（%）=實驗組A/正常對照組A×100%。

1.5 流式細胞儀檢測OCI-LY1細胞凋亡率 將OCI-LY1細胞懸液以每孔2×105個細胞、每孔2 mL接種于6孔板，待細胞沉淀后，用不同質量濃度的半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細胞，培養24小時；收集細胞，用Binding buffer洗滌細胞后，加入4 μL PI染色，重懸細胞，再加入10 μL Annexin V-APC染色，避光15分鐘后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.6 PI-FACS細胞周期檢測 將OCI-LY1細胞懸液培養于6 cm dish中，用不同質量濃度半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細胞，培養24小時；收集細胞離心后，經4℃D-Hanks洗滌、75%乙醇固定處理后，按PI∶RNase∶D-Hanks=25∶10∶1000配比進行細胞染色，用流式細胞儀檢測并分析數據。

1.7 Western blotting法檢測cyclin D3蛋白的表達用不同質量濃度半枝蓮二萜J（0、20、40、60 μg/mL）處理細胞，培養24小時后收集OCI-LY1細胞，PBS洗滌兩次，加入RIPA裂解液，冰上裂解10分鐘，轉移至EP管中，超聲破碎細胞（40 w，每次1秒，間隔2秒，共20次）。4℃、12000 g，離心15分鐘，測定蛋白濃度。每條泳道加蛋白50 μg，進行SDS-PAGE，并轉移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉PVDF膜1小時，與一抗cyclin D3室溫孵育2小時，并用TBST洗膜4次，每次8分鐘；再與二抗室溫孵育1.5小時，并用TBST洗膜。將PVDF膜置于暗盒，膠片曝光，沖洗膠片，并檢測蛋白表達情況。

1.8 統計學處理方法 采用IBM SPSS 23.0軟件進行數據分析，以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞增殖的影響半枝蓮二萜J可以明顯抑制OCI-LY1細胞增殖，并呈時間和劑量依賴性（圖1），不同質量濃度半枝蓮二萜J作用下，細胞增殖抑制率均高于DMSO對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞增殖的影響

2.2 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞凋亡的影響比較不同質量濃度半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞凋亡的影響后發現，加入20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組和不加藥組壞死細胞之間沒有出現差異（P＞0.05），但早期凋亡和晚期凋亡率之間的差異有統計學意義（P＜0.05）；加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后的細胞壞死率、早期和晚期凋亡率與不加藥組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1，圖2。

圖2 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞凋亡的影響

表1 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞凋亡的影響（±s，n=3）

表1 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞凋亡的影響（±s，n=3）

濃度（μg/mL）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）壞死率（%）存活率（%）0 20 40 60 1.90±0.26 3.83±0.25 4.50±0.26 7.03±0.42 1.60±0.17 2.80±0.26 10.77±0.31 28.40±0.79 0.77±0.15 0.77±0.25 3.83±0.75 5.93±0.85 95.70±0.36 92.57±0.42 80.97±0.32 58.63±0.21

2.3 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞周期的影響作用24 h后，比較不同質量濃度半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞周期的影響后發現，與不加藥組相比，加40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后處于各個周期的細胞總數之間均存在統計學差異（P＜0.05）；在加入20 μg/mL半枝蓮二萜J中，只有處于S期的細胞總數與之相比差異無統計學意義（P＞0.05），處于G0/G1期和G2/M期的細胞總數之間差異有統計學意義（P＜0.05），見表2，圖3。

圖3 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞周期的影響

表2 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞周期的影響（±s，n=3）

表2 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞周期的影響（±s，n=3）

質量濃度（μg/mL）0 20 40 60細胞周期分布（%）G0/G1 S G2/M 51.09±0.72 54.44±0.79 73.48±0.87 66.21±0.56 34.61±0.63 33.95±0.49 17.96±1.02 26.54±0.57 14.30±0.24 11.61±0.37 8.56±0.35 7.24±0.44

2.4 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞cyclin D3蛋白表達的影響 用不同質量濃度（0、20、40、60 μg/mL）半枝蓮二萜J處理OCI-LY1細胞后，在31kDa處檢測到目標條帶，其cyclin D3蛋白表達均明顯減弱，并呈劑量依賴性，見圖4。

圖4 半枝蓮二萜J對OCI-LY1細胞cyclin D3蛋白表達的影響：半枝蓮二萜J（μg/mL）

3 討論

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，始載于《藥鏡拾遺賦》。其性辛、苦、寒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[7]。在中醫治療中，常用其單方或復方治療各種腫瘤[8]。半枝蓮的藥理研究證實，其提取物在體外和體內是肝癌的有效抑制劑[9]。從半枝蓮中分離得到的葉綠素a的衍生物，可以通過抑制P-糖蛋白的表達，并誘導HepG2的細胞周期阻滯來降低耐藥性[10]。本實驗結果表明，半枝蓮二萜J能夠抑制OCI-LY1細胞增殖，且具有時間和劑量依賴性，并使cyclin D3表達降低，呈劑量依賴性。

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，半枝蓮二萜J以劑量依賴性方式誘導OCI-LY1細胞凋亡，隨劑量的遞增，其早期凋亡率和晚期凋亡率均增大。但在20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組和不加藥組凋亡細胞之間沒有出現差異，而加入40 μg/mL和60 μg/mL半枝蓮二萜J處理后的細胞凋亡率與不加藥組之間均出現統計學差異，推測可能是隨著劑量的增加，細胞凋亡越來越明顯，進一步支持了其對細胞凋亡的影響。

本研究在細胞周期方面的結果顯示，半枝蓮二萜J主要使細胞阻滯于G0/G1期，隨劑量濃度的增大，處于G0/G1期的細胞逐漸增多，在質量濃度40 μg/mL時達到峰值。同時，隨半枝蓮二萜J質量濃度的增大，處于S期的細胞也逐漸減少，在質量濃度40 μg/mL時達到峰值。但在S期中，20 μg/mL半枝蓮二萜J處理組相比不加藥組之間的差異并沒有統計學意義，推測可能由于藥物質量濃度小導致差異不明顯。另外，G2/M期細胞也以劑量依賴的方式逐漸減少，說明半枝蓮二萜J對OCILY1細胞周期的阻滯作用。

由于細胞周期蛋白在細胞周期調控中的重要作用，細胞周期依賴性蛋白激酶（Cyclin Dependent Kinases,CDKs）和周期蛋白被廣泛研究[11]。D型細胞周期蛋白（cyclin D）作為有絲分裂傳感器，直接將生長因子信號與G1期進展聯系起來。同時，cyclin D的降解與大量人類腫瘤相關[12]。cyclin D包括3個亞型：cyclin D1、cyclin D2和cyclin D3，能促進細胞增殖，同時加快細胞周期進程。cyclin D3是G1期CDK4/CDK6的調節亞基，同時作為CDK11P58的伙伴，參與G2/M期的調節[13]。最近有研究證實，cyclin D3與CDK1、CDK2和CDK14之間也有一定相關性[14]。在淋巴造血系統的研究中，cyclin D3被認為是與中國非霍奇金淋巴瘤發病關系最密切的D類細胞周期蛋白，其表達水平與惡性程度呈明顯正相關[15]。本研究采用Western blotting法檢測不同質量濃度半枝蓮二萜J作用OCI-LY1細胞，cyclin D3在蛋白水平的表達變化后發現，半枝蓮二萜J以劑量依賴方式使OCI-LY1細胞cyclin D3蛋白表達降低，推測cyclin D3的表達下調可能與彌漫性大B細胞淋巴瘤的發生、發展有關。

彌漫性大B細胞淋巴瘤作為我國最常見的淋巴造血系統腫瘤，治療方法多以化療為主[16-17]，但對于部分復發難治的患者，療效仍不能讓人滿意。本研究以彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞株OCI-LY1細胞為研究對象，發現半枝蓮二萜J可以通過下調cyclin D3的表達從而阻滯腫瘤細胞周期進展并誘導細胞凋亡，隨著研究的逐漸深入，有望為彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療帶來新的可能。